453例胃癌患者胃黏膜幽门螺杆菌毒力相关基因分型及抗生素耐药性分析▲

李倩倩 李伟之 饶秦文 吴育美

(1 西安医学院附属宝鸡医院胃肠镜科，陕西省宝鸡市 721006，电子邮箱：baolqianqian@163.com；2 西安交通大学第一附属医院消化内科，陕西省西安市 710061；3 陕西省宝鸡市中心医院消化科，宝鸡市 721008)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是定植于胃黏膜上皮细胞的革兰阴性菌，Hp感染与多种胃肠疾病的发生有密切关系[1-2]。世界卫生组织/国际癌症研究机构于1994年将Hp定为胃癌的Ⅰ类致癌原，也是当前唯一确定为Ⅰ类致癌原的细菌性病原微生物[3]。全球近一半人群存在HP感染情况，然而Hp相关的胃溃疡、十二指肠溃疡发病率却远不及其感染率高，且其患病类型多样化[4]。微生物的血清型或基因型不同常会导致其感染与结局的差异，而病原菌的毒力是影响疾病程度的重要因素之一[5]。此外，细菌的抗生素耐药现象也是当前Hp根除治疗中所面临的重要问题。由于Hp分离培养和药敏实验的开展相对比较困难，专家普遍建议通过了解当地的抗生素耐药率来决定Hp的根除疗法[6-7]。因此，本研究分析西安医学院附属宝鸡医院收治的453例胃癌患者Hp感染的情况，分析其毒力基因及分型，同时对Hp进行抗生素敏感性试验，为了解该地区Hp对抗生素的耐药性，以及临床选择治疗方法提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月至2019年12月期间西安医学院附属宝鸡医院收治的453例胃癌患者作为研究对象，其中男性261例，女性192例，年龄58～73 (68.2±1.7)岁。患者均经胃镜病理活检确诊，且经13C呼气试验检测均呈阳性，排除1个月内服用抗生素、铋剂和质子泵抑制剂者。本研究经由我院伦理委员会批准，且所有患者均签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器 2.5 L微需氧产气袋及密封培养盒(日本三菱化学株式会社，批号：9235ZJ-2)，阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星E-Test药敏条均购自法国生物梅里埃公司(批号：412243、412315、412404、412393)，细菌基因组DNA提取试剂盒、Taq PCR MasterMix扩增试剂均购自北京天根生物技术有限公司(批号：OSR-M401)，PCR仪和凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司，Hp标准菌株NCTC11637来源于本院实验室。

1.3 方法

1.3.1 Hp菌株的鉴定：取453例研究对象的胃黏膜组织标本，经全自动组织研磨仪充分研磨后制成组织匀浆，用无菌胶头滴管将组织混悬液接种于Hp选择性培养基(重庆庞通医疗器械有限公司)上，在厌氧条件下用凡士林封口密闭培养，5～7 d后观察培养基上的菌落形态，挑选出疑似Hp的菌落(透明细砂或水滴样，针尖大小，0.1～1 mm直径)，革兰染色后镜检，氧化酶、脲酶和触酶试验均呈阳性，可鉴定为Hp。本研究共获得62株Hp临床分离株，并于-80℃保存待检。

1.3.2 Hp毒力相关基因分型检测：本研究检测的Hp毒力基因包括细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)、细胞空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A, VacA)s1、VacAs2、VacAm1、VacAm2，参考相关文献[8]对基因保守区域片段设计特异性引物，具体的特异性引物序列见表1所示。将冻存于-80℃的Hp临床分离株在血平板中复苏培养48 h，使用生理盐水冲洗菌落后按照试剂盒说明书提取DNA。采用PCR进行Hp毒力基因的扩增和测序。PCR具体实验参数和步骤为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，52～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共持续35个循环；72℃温育5 min，4 ℃保存。必要时可对可疑条带进行胶回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表1 特异性引物序列

1.3.3 抗生素耐药性试验：将冻存于-80℃的Hp临床分离株在血平板中复苏培养48 h，将复苏成功并传代一次的菌株用0.45%氯化钠溶液稀释为2.0麦氏单位菌悬液，均匀涂布于M-Ⅱ血平皿中，并贴上阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的E-test药敏试条，于微需氧条件下培养3 d后观察结果，于椭圆形抑菌环与E-Test试条交界点读取最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。使用NCTC11637菌株作为质控菌株。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计数资料以例数或百分率表示。

2 结 果

2.1 Hp毒力相关基因检测结果 453例胃癌患者的胃黏膜标本中共分离出62例Hp临床菌株，其中CagA检出率为100.0%(62/62)，VacAs1a、VacAs1a+VacAm1、VacAs1a+VacAm2、VacAs1a+VacAs1c+VacAm2、VacAs1c+VacAm2和VacAm1+VacAm2检出率依次为19.35%(12/62)、46.77%(29/62)、8.06%(5/62)、8.06%(5/62)、8.06%(5/62)、9.68%(6/62)，大多数患者同时携带多个亚型。

2.2 Hp抗生素耐药性试验 62株Hp临床株，对阿莫西林的耐药率最高，达到79.03%(49/62)，MIC范围为0.016～32.000 mg/L；对克拉霉素的耐药率为61.29%(38/62)，MIC范围为0.016～256.000 mg/L；对甲硝唑的耐药率为58.06%(36/62)，MIC范围为0.016～125.000 mg/L；对左氧氟沙星的耐药率为22.58%(14/62)，MIC范围为0.008～32.000 mg/L；对四联抗生素的耐药率为20.97%(13/62)，MIC范围为0.006～24.000 mg/L。

3 讨 论

Hp感染率高而胃肠道疾病发病率低、发病表型多样化的特点已逐渐引起学者们广泛关注，但其具体机制仍未完全明确，一般认为Hp的毒力相关基因可能是其中一项原因。研究表明，Hp的主要毒力因子涉及黏附、炎症、免疫等方面，包括CagA、VacA、上皮细胞接触诱导因子(induced by contact with epithelium gene A,IceA)、前炎性外膜蛋白等[8]。本研究结果显示，62例Hp临床菌株中CagA检出率占100.0%(62/62)，而VacAs1a、VacAs1a+VacAm1、VacAs1a+VacAm2、VacAs1a+VacAs1c+VacAm2、VacAs1c+VacAm2和VacAm1+VacAm2检出率依次为19.35%、46.77%、8.06%、8.06%、8.06%、9.68%，说明大多数患者同时携带多个亚型。有学者认为，IceA基因的IcaA1亚型可能与胃溃疡的发生密切相关[9]。VacA基因根据其S区、M区可分为2个等位基因，其中VacAs1m1较VacAs1m2具有较强的细胞毒性，而VacAs2m2无细胞毒性[10]。最近的研究也显示VacAs1相关亚型与消化道炎症有相关性，而VacAs2相关亚型并未发现相关性[11]。本研究未检测到VacAs2亚型菌株，可能与本研究只纳入胃癌患者及样本量较少有关。

Hp感染尽管仅部分发生于消化道溃疡、Hp相关消化不良、恶性肿瘤，但感染者几乎都存在慢性活动性胃炎，即Hp胃炎。《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》指出，对于Hp胃炎患者应采取根除疗法，包括无症状患者[12]，而Hp的根除治疗多根据区域内抗生素的耐药情况而制定。本研究结果显示，62株Hp临床株中，对阿莫西林的耐药率最高，达到79.03%，而对左氧氟沙星的耐药率最低，为 22.58%。《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》推荐如果该区域内Hp对两种抗生素的双重耐药率>39.3%，则不推荐含这两种抗生素的非铋剂四联疗法，提示该区域尚可使用含其他抗生素的方案，但仍需密切关注抗生素耐药率的动态变化[12]。本研究中，Hp对四联抗生素的耐药率为20.97%，均低于4种抗生素单独用药的耐药率，因此可考虑我国拓展的相关铋剂四联方案[质子泵抑制剂+铋剂+阿莫西林+甲硝唑(或四环素)][12]。

综上所述，我院胃癌患者胃黏膜Hp菌株毒力相关基因最常见为CagA基因，可使用耐药性相对较低的左氧氟沙星或者抗生素四联疗法进行治疗。Hp感染与疾病发生相关性的研究中，除需进一步了解毒力基因外，还应该考虑宿主易感性因素、基因多态性或者多因素分析(如社会经济学、营养学等因素)可能产生的影响[13]，这也是我们下一步进行实验探讨的方向。