血清microRNA-200c在原发性肾病综合征中的表达及临床意义分析

万 菁 白 微 陈 红 奚经巧 郭跃丽

（浙江中医药大学附属温州中医院检验科，浙江 温州 325000）

原发性肾病综合征（primary nephrtic syndrome，PNS）是临床常见的一组肾脏疾病综合征。肾病综合征已成为临床上最常见的肾小球疾病，其发病率呈逐年上升趋势[1-2]。目前，原发性肾病综合征的诊断和预后预测主要依靠血和尿生化检测（如尿蛋白、血人血白蛋白、血脂水平和尿量等）和创伤性检查（如肾脏穿刺活检）。然而，尚缺乏理想的生物标志物用于原发性肾病综合征的诊断和用于激素治疗效果和预后预测[3]。近年来，miRNA（MicroRNA）作为疾病的新分子标志物得到学者们的广泛关注，然而，microRNA在肾病综合征的应用研究仍处于起步阶段[4-5]。因此，本研究拟探索原发性肾病综合征患者血清microRNA-200c的表达水平变化情况，并探讨其临床价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象：采用严格筛选、遵循自愿原则，选取在本院首诊并诊断为原发性肾病综合征的160例患者作为病例组研究对象；同时，按照1∶1 匹配的方法另选取160名同期健康体检人员为对照组，对照组匹配的主要要求：年龄相差＜2岁、性别一致、民族一样、经济收入相当、职业相当、居住条件相当。

1.2 资料收集方法：收集所有患者和对照组的病史，检测患者和对照组血液和尿液标本，检测他们的血常规、尿常规和血液相关生化指标。所有研究方案均通过温州市中医院伦理委员会批准，并按照Helsinki国际宣言，在原发性肾病综合征研究中，告知参与者本研究的内容及意义，在完全志愿的基础上签署知情同意书后收集。

1.3 诊断标准：依据人民卫生出版社出版的《内科学》中关于原发性肾病综合征的诊断标准：大量蛋白尿，24 h尿蛋白含量超过3.5 g/L，血浆白蛋白＜30 g/L，胆固醇＞5.7 mmol/L，并且伴有不同程度水肿。

1.4 纳入和排除标准：所有入选患者均经临床确诊，并符合原发性肾病综合征诊断标准，近期内未服用激素等药物进行治疗。排除标准：排除继发性肾病综合征患者，排除合并心脏病、肿瘤以及严重肝功能异常者以及有精神类和神经病史患者。

1.5 标本采集及检测：所有患者的血清和尿液样本均在首诊后未接受治疗前采集，处理过程严格按照如下步骤进行：收集原发性肾病综合征患者和正常对照的全血及尿液样本。收集的血清和尿液样本在室温下3000 g离心10 min去除细胞并收集上清，然后将收集的上清在4 ℃条件下，12000 g离心5 min，进一步去除残留的细胞，离心后收集上清置于干净的Eppendoff管中-80 ℃保存待用。另外，所有研究对象测定血尿常规、血浆总蛋白、白蛋白、血肌酐、尿素氮和血浆胆固醇和三酰甘油及24 h尿蛋白定量和病理亚型等指标。

1.6 试剂：Trizol试剂（美国Invitmgen），miRNeasy mini kit（美国QIAGEN公司）；miRNA-200c及U6引物试剂盒（上海生工）。

1.7 血清RNA提取：常温下解冻样本，取血清样本100 μL血清按Trizol试剂和miRNeasy mini kit说明书提取总RNA。外光分光光度计（NanoDrop 2000）进行血浆总RNA浓度和纯度的鉴定，变性凝胶电泳法检测RNA完整性，放入-80 ℃低温冰箱留存待用。

1.8 实时荧光定量聚合链反应（qPCR）检测血清miRNA-200c表达水平：使用miScriptⅡ反转录试剂盒将1 μg RNA反转录为cDNA，采用miScript SYBR Green PCR试剂盒，以U6为RNA内参进行qPCR检测血清miRNA-200c表达水平，反应条件参照试剂盒说明书设置。miRNA-200c：5’-GCGCTAATACTGCCGGGTAATGAT-3’，77bp；U6：5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’，94 bp。miRNA-200c相对表达水平采用2-△△Ct法计算，实验重复3次。

1.9 统计学方法：运用SPSS20.0统计软件建立数据库并进行统计分析，计量资料的统计描述用±s表示，两组均数的比较用独立样本的t检验，定性资料的描述采用率或构成比，组间的率或构成比的比较采用χ2检验；运用Pearson或者秩相关性检验分析肾病综合征患者血清中miRNA-200c表达水平与临床检测指标的相关性；采用多多元Logistics回归分析肾病综合征的主要影响因素。

2 结果

2.1 两组人群一般情况比较：入组本研究的病例组和对照组分别由160例，均为72例男性人和88例女性。其中，病例组平均年龄（36.37±6.28）岁（18～68岁），对照组平均年龄（36.26±7.01）岁（18～69岁），无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。

2.2 两组人群的生活行为和临床指标对比：病例组和对照组的饮酒率、糖尿病史、空腹血糖、高密度脂蛋白（HDL）等指标差异无统计学意义（P＞0.05）。而病例组患者的吸烟率、BMI、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和β2-MG均高于对照组（P＜0.01），见表1。

表1 病例组和对照组之间相关行为和实验室检测结果对比（±s）

表1 病例组和对照组之间相关行为和实验室检测结果对比（±s）

2.2 两组人群血清microRNA-200c的表达水平分析：运用qPCR技术，检测了肾病综合征患者和健康对照组血清microRNA-200c的表达水平，结果显示病例组的血清microRNA-200c的表达水平为（6.869±0.768），明显高于对照组血清microRNA-200c的表达水平（1.138±0.151），有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 microRNA-200c与肾病综合征患者相关指标的相关性分析：采用相关分析探索microRNA-200c与肾病综合征患者临床指标的相关性，结果显示患者血清中microRNA-200c的表达与BMI、TC、TG、LDL及β2-MG呈正相关，与其他指标无相关性（P＞0.05），见表2。

2.4 肾病综合征影响因素的多元Logistics回归分析：在单因素logistic回归分析基础上，引入单因素分析有显著性意义的因素，作多因素Logistic回归分析，采用Backward：LR法，建立回归模型，筛选出5个影响因素最终进入回归方程，显示BMI（OR=1.994）、TC（OR=3.061）、LDL（OR=3.551）、β2-MG（OR=2.231）、microRNA-200c（OR=8.147）是肾病综合征的主要危险因素，其中microRNA-200c与肾病综合征的关联强度最大，见表3。

表2 血清中microRNA-200c与相关指标的相关性分析

表3 肾病综合征影响因素的多元Logistic回归分析结果

3 讨论

原发性肾病综合征是临床上常见的肾小球疾病。近年来，本病的发病率有上升的趋势[6]。目前，对于肾病综合征的发病机制尚不完全清楚，若不及时给予有效治疗，可能引发肾小管损伤、急性肾功能不全等并发症，严重者可发展为慢性肾衰竭[7-8]。肾病综合征早期症状不明显，患者就诊时往往已发展至终末期肾病。因此，探寻可靠、稳定和准确的方法来早期诊断本疾病，对及早采取正确的治疗方法进行早期干预具有重要的临床意义。

miRNA（MicroRNA）是一类长21～25 nt的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区，具有高度保守性。近年的研究发现，miRNA在很多疾病的发生发展中具有重要的调控功能[9-10]。miR-200c是miR-200家族成员之一，其定位于染色体12p13.31[11]。miR-200c在肿瘤方面的研究较多，它在多种恶性肿瘤中异常表达，具有极强的抑癌基因活性，与上皮间质转化（EMT）、肿瘤细胞的生长、增殖：侵袭、转移及化疗药物敏感性密切相关[12]。然而，microRNA-200c在肾病综合征角色的研究甚少。wang等[13]对尿液miRNAs进行研究发现IgAN患者尿miR-200a，miR-200b和miR-429水平下降。尿部分miRNA下降明显的患者其蛋白尿水平较高，基线肾功能较差。随访（33.4±12.6）个月后，基础尿miR-200b（r=0.316，P=0.034）较低患者其肾功能减退亦较明显，提示这些尿miRNA片段对于原发性肾病综合征的临床表现及预后相关。他还发现，尿miR-29a，miR-192和miR-200c可能是诊断肾病综合征和判断疾病严重程度的生物标志物[14]。然而，miR-200c与原发性肾病综合征的相关临床指标关系如何，它与原发性肾病综合征发生发展的关系如何仍未被阐明。

本研究选取在首诊并诊断为原发性肾病综合征的160患者作为病例组研究对象，按照1∶1 匹配的方法另选取160同期健康体检人员为对照组。收集他们的临床信息和血液样本，检测他们的血生化指标，并采用定量PCR技术检测两组人群血清microRNA-200c表达水平，分析其临床意义。结果显示原发性肾病综合征患者血清中microRNA-200c的表达水平上调，它的表达与肾功能损伤和血脂指标具有相关性。肾病综合征患者中，肾功能损伤指标和血脂指标是反应病情变化的重要指标，而本研究发现这两类指标与microRNA-200c的表达相关性明显，提示microRNA-200c可能与肾病综合征的发生和发展过程密切相关。

本研究采用多元回归分析方法，发现BMI、TC、LDL、β2-MG、microRNA-200c是肾病综合征的主要危险因素，其中microRNA-200c与肾病综合征的关联强度最大，它是肾病综合征发病的独立危险因素，提示microRNA-200c可能是肾病综合征潜在的新分子标志物。当然，本研究只是横断面研究方法探索microRNA-200c在肾病综合征中的角色，它对肾病综合征的诊断价值和预后预测能力，有待后续深入研究。