探讨实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析

罗周正 张丽艳 李 贺 杜 波

（阜新市卫生健康服务中心（阜新市疾病预防控制中心）检验检测部，辽宁 阜新 123000）

流感在临床上属于流感病毒引发的一种急性呼吸道传染病，因流感病毒属于RNA病毒，且潜伏期短，传染性较强及已发生变异等特点，一旦感染流感病毒，严重降低了患者的生活质量，甚至威胁生命健康。临床通常采取分离病毒、鉴定病毒或细胞培养作为检测流感病毒的常用手段，但因消耗时间长，特别是针对爆发疫情时难以满足病毒诊断的要求。据有关临床实验室最新研究表示，实时荧光定量PCR技术被广泛应用在临床实践中，除有操作简便、灵敏度及自动化程度高外，还对核酸具备较高的扩增性及检测快等优势，深得广大患者一致好评与认可[1]。因此，为对实时荧光定量PCR技术在流感病毒检测中的诊断价值进一步探讨，本研究对我市哨点医院采集疑似流感病毒样本检测后予以临床分型，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：回顾分析于2018年10月至2019年3月期间前来我市哨点医院就诊疑似流感病毒患者共530例纳入本次实验，并对以上对象流感病毒样本进行采集。530例流感病毒样本中包含男性患者330例、女性患者200例；科室包含儿科门诊患者110例、内科门诊患者190例、呼吸科病房患者230例。以上所有标本采集、存储、运输等各项操作均依据《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案》有关文件进行执行。将采集的所有标本及时送往流感监测网络实验室，并由检验人员在规定时间内完成检测。针对未能在24h完成的检验，应置于-70 ℃的环境下冷冻保存。

1.2 检验仪器与检验方法

1.2.1 仪器型号与试剂：ABI 7500 Fast荧光PCR扩增仪（美国Thermo公司生产）；核酸提取采用RNA病毒提取试剂盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司，货号74104）；PCR反应试剂（硕世生物科技有限公司）；狗肾传代细胞（由辽宁省疾病预防控制中心感染与传染性疾病防制所提供）[2-3]。

1.2.2 标本采集和处理：采用核酸提取盒实时荧光定量PCR法提取样本季节性H1亚型、季节性H3亚型、新甲H1亚型、H5、H7、H9等亚型检测，且所有操作过程均依据试剂盒使用说明说进行操作[2]。按照说明，将RNA经过反转录处理后扩增，扩增条件为，50 ℃ 30 min，1个循环，95 ℃ 5 min，1个循环，95 ℃ 10 s，45个循环，55 ℃ 40 s，45个循环，最后采取FAM信道在55 ℃下单点荧光检测[3-4]。

1.2.3 病毒细胞分离鉴定：采集样本中适当加入10000 U/mL双抗接种于单层狗肾传代细胞，并注意观察细胞病变，对病毒培养液进行细胞凝血试验，结合细胞病变及细胞凝集进行检测。若凝集试验符合1∶16以上的细胞培养，可采用有关亚型标准血清给予红细胞凝集抑制试验来作为流感病毒型别和亚型的鉴定[5-6]。

1.3 观察指标：统计两组检测方式对阳性流感病毒及临床分型（新甲H1型、H3亚型、B型）阳性检出率情况。

1.4 统计学方法：采用SPSS22.0统计学软件，卡方检验以P＜0.05作为差异有统计学意义；则两个连续变量间呈线性相关时，使用Pearson积差相关系数进行分析。

2 结果

2.1 比较两组检测方法对流感病毒样本不同分型检测结果情况，见表1。

2.2 比较两组检测方法对阳性流感病毒不同分型检出率情况，见表2。

表1 两组检验方法流感病毒检测结果对比

表2 两组检测方法对阳性流感病毒不同分型检出率对比（n，%）

3 讨论

流感病毒最常用的检测方法较多，包含PCR、血清学诊断以及细胞培养法，即可保证流感病毒的抗原性和原始标本保持一致性，加上利于长时间保存，能够更好的对病毒抗原性及基因进行分析。经最新研究成果表明，因细胞培养法的检出率受到大量病毒载量及样本质量影响，一旦样本质量低或病毒载量不够时，极易存在一定的假阴性[7-8]。与此同时，细胞培养法处于局限性，为确保病毒活性，只能单纯用于活体病毒[9]。

实时荧光定量PCR技术在临床上主要适用于流感、禽流感、麻疹、手足口病等传染性疾病诊断，且在食品安全上、科学研究等方面也发挥了重要作用[10]。本研究通过采用实时荧光定量PCR法，针对流感病毒鉴别多株多亚型流感病毒，具有实时荧光定量PCR技术主要是通过扩增至每一个循环产物荧光信号，进而能够对达到扩增反应产物进行定量和定性分析，伴随产物的增多，进一步促使荧光信号强度增强，若经过一个循环后，自然被荧光强度信号收集。较高的特异性及灵敏性[11-12]。经国内有关临床实践表示，实时荧光定量PCR具有操作便捷、反应速度快、具备较强的敏感性及直观性，通过定量检测深得临床医师及患者满意的效果[13]。

本次研究证实了实验组检出89例阳性标本，阳性率为16.79%，其中包括新甲H1型71例、H 3亚型14例、B型4例；则参照组检出57例阳性标本，阳性率为10.75%，包括新甲H1型52例、H 3亚型3例、B型2例，实验组高于参照组，P＜0.05。由此说明，通过选自2018年10月至2019年3月对我市哨点医院收集的530例疑似流感病毒携带者样本进行检测后发现，使用实时荧光定量PCR法检测出的阳性率更高，且两组均未查出H5、H7、H9型，且在进入11月-次年1月份流感病毒的检出率相对较高，是引发流感病毒的传播及扩散的最佳时机，冬季天气寒冷，人体抵抗力减弱，容易受寒。加上，人们多半时间在室内活动，窗户常管闭，导致空气不流通，病毒更容易传播。

综上所述：较细胞培养法而言，选择实时荧光定量PCR法应用在流感病毒诊断中的临床价值更高，值得进一步推广与借鉴。