藁本内酯通过改善骨骼肌糖利用提高老年小鼠运动能力

杜旌畅 向长贞 张红梅 雷连曼

衰老是人必需面对的自然演进过程。随着年龄增长，机体出现一系列渐进性的衰退。骨骼肌是人体最先出现衰老的组织［1］，表现为肌肉力量减退、恢复时间延长等。延缓老年人肌肉功能的降低，对缓解人体衰老有积极意义。藁本内酯在伞形科植物中含量丰富，是中国传统药材当归、川芎的重要有效成分。藁本内酯具有多样的药理作用。课题组前期研究发现，藁本内酯对模拟缺血环境的血管内皮细胞有明显的保护作用［2］。另有研究证实，藁本内酯能够抑制细胞炎症，对抗心肌组织缺氧损伤［3］。目前，藁本内酯对衰老肌肉组织的作用尚缺乏报道。本研究采用小鼠爬杆和负重游泳模型，结合检测肌肉组织相关因子的表达，评价藁本内酯对衰老小鼠肌肉功能及糖合成、代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康昆明种小鼠18只，雄性，12月龄，体质量（40±5）g；由成都达硕实验动物有限公司提供。实验动物常规饲养于24℃恒温动物房中，光照∶黑暗=14∶10，经1周适应性喂养后进行实验。

1.2 药品与试剂 藁本内酯（成都曼思特生物科技有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成生物有限公司）；乳酸测试盒（南京建成生物有限公司）；总蛋白定量测定试剂盒（南京建成生物有限公司）；糖原试剂盒（Solarbio）；Anti-GSK-3β蛋白一抗（Cell Signaling Technology）；Anti-GSK3 beta（phosphor S9）蛋白一抗（Abcam）；β-Actin（北京博奥森）；兔二抗（Cell Signaling Technology）；硫酸、甲醇为分析纯（成都科龙化工）。

1.3 仪器 高通量电泳系统及转印槽（美国Bio-Rad）；凝胶化学发光检测仪（美国Bio-Rad）；全波长酶标仪（美国Biotek）；微量匀浆仪（美国 Thermo）；离心机（美国 Thermo），纯水仪（美国 Thermo）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与给药：18只小鼠随机均等分为对照组（B组）、藁本内酯每日给药组（LE组）、藁本内酯间日给药组（LD组）3组。藁本内酯使用生理盐水稀释至2 mg/mL。B组每日灌胃生理盐水0.3 mL，LE组每日50 mg/kg灌胃藁本内酯，LD组单日50 mg/kg灌胃藁本内酯、双日灌胃生理盐水0.3 mL。所有动物每日灌胃1次，共给药14 d；完成后，于第15天进行爬杆实验，第16天进行力竭游泳实验，第17天取组织进行相关因子的检测。

1.4.2 爬杆实验：将小鼠放在长50 cm垂直悬空的光滑玻璃棒上端，使小鼠肌肉一直处于紧张状态，记录小鼠在玻璃棒停留至滑落的时间，累计测量3次，记录每只小鼠爬杆总时间。

1.4.3 力竭游泳实验：小鼠尾根部负荷5%体质量的铅皮块，置小鼠在水箱中游泳。水箱大小为400 mm×600 mm×400 mm，水深（35±1）cm，水温（25±2）℃。以小鼠头部沉入水底10 s不能浮出水面记为体力耗竭，记录每只小鼠力竭游泳时间。

1.4.4 组织获取：小鼠于第17天进行非负重游泳30 min，休息60 min后处死。股动脉取血处死小鼠，同时收集动脉血约1000 μL，4℃静置30 min，离心机3000 r/min离心10 min后取上清备用；迅速取出动物腓肠肌组织约0.3 g于1 mL生理盐水中，微量匀浆仪中匀浆，进行后续因子的测定。

1.4.4.1 血清中乳酸、LDH含量测定：取适量血清使用生理盐水稀释后，严格按照试剂盒步骤操作，采用比色法检测血清乳酸、LDH水平。

1.4.4.2 肌肉组织中糖原及总蛋白含量测定：取适量组织匀浆液，严格按照试剂盒步骤操作，采用比色法检测肌肉组织中糖原水平，并计算单位体积总蛋白含量。

1.4.4.3 肌肉组织中糖原合成激酶-3β（GSK-3β）及其磷酸化（p-GSK-3β）水平测定：采用Western blot法检测组织中GSK-3β及p-GSK-3β水平，以β-Actin为内参计算相对含量。按照western蛋白提取试剂盒说明书提取肌肉组织蛋白后分装保存在-80℃的冰箱待用。将肌肉组织蛋白样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜60 min，封闭2 h，加入GSK-3β及其磷酸化蛋白一抗，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的兔抗鼠Ig G（1∶3000），孵育，ECL显影，曝光。采用 Quantity One软件进行灰度分析，GSK-3β与内参β-Actin灰度的比值即为GSK-3β的相对含量，以p-GSK-3β与GSK-3β灰度的比值即为GSK-3β的相对磷酸化水平。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 藁本内酯对小鼠爬杆时间及力竭游泳时间的影响 结果显示，与B组比较，LE组与LD组小鼠的爬杆时间、力竭游泳时间均显著延长（P＜0.05），2种给药方式之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 藁本内酯对小鼠爬杆及力竭游泳时间的影响（±s，s，n=6）

表1 藁本内酯对小鼠爬杆及力竭游泳时间的影响（±s，s，n=6）

注：与B组比较，*P<0.05

组别 爬杆时间 力竭游泳时间B 组 63.17±10.42 194.0±32.92 LE 组 84.50±13.72* 296.7±44.36*LD 组 81.83±11.75* 267.3±29.68*

2.2 藁本内酯对小鼠血清中乳酸与LDH含量的影响 与B组比较，LE组与LD组小鼠血清中的乳酸与LDH含量均显著降低（P＜0.05）；与LD组相比，LE组小鼠血清中的乳酸与LDH含量也均显著降低（P＜0.05）。见表 2。

表2 藁本内酯对小鼠血清中乳酸、LDH含量的影响（±s，n=6）

表2 藁本内酯对小鼠血清中乳酸、LDH含量的影响（±s，n=6）

注：与B组比较，*P<0.05；与LE组比较，△P<0.05

组别 乳酸（mmol/L） LDH（U/L）B 组 515.2±19.60 615.1±60.19 LE 组 374.0±19.08* 354.7±52.37*LD 组 411.3±26.53*△ 477.9±39.99*△

2.3 藁本内酯对小鼠肌肉组织中糖原、GSK-3β及其磷酸化水平的影响 与对照组相比，LE组与LD组小鼠组织中糖原含量均显著升高（P＜0.05），而2种给药方式之间差异无统计学意义，见表3。3组GSK-3β的总量差异无统计学意义（P＞0.05），但LE组与LD组GSK-3β磷酸化水平较B组显著增高（P＜0.05），且与LD组相比，LE组GSK-3β的磷酸化水平更高（P＜0.05）。见表 3，图 1。

表3 藁本内酯对小鼠血清糖原含量的影响（±s，n=6）

表3 藁本内酯对小鼠血清糖原含量的影响（±s，n=6）

注：与B组比较，*P<0.05

组别 糖原含量B 组 0.0682±0.01459 LE组LD组0.1499±0.02235*0.1251±0.01225*

图1 藁本内酯对小鼠肌肉组织中GSK-3β及其磷酸化水平的影响（±s，n=3）

3 讨论

骨骼肌功能退化是衰老的重要表现，老年人衰老不仅表现为骨骼肌质量下降，肌肉耐力、爆发力等也会明显退化。糖的利用能力对骨骼肌功能有重要影响，随着年龄增长，骨骼肌对于糖的利用能力也在降低。研究发现，衰老抑制了骨骼肌表面葡萄糖转运蛋白mRNA的转录，提示其对细胞摄取葡萄糖有抑制作用［4］。进一步研究发现，骨骼肌利用葡萄糖能力的降低与细胞胰岛素抵抗（IR）状态有直接联系［5］。改善骨骼肌对糖的利用，对于改善衰老肌肉的功能有巨大帮助。

藁本内酯具有广泛的生物学效应，可对抗缺血损伤、舒张平滑肌、抑制神经炎症［6-8］。本研究通过爬杆试验和力竭游泳实验，探讨不同给药频率下藁本内酯对老年小鼠力量与耐力的影响。结果显示，2种藁本内酯给药频率均能够显著提升小鼠力量与耐力，不同给药频率之间差异无统计学意义。在相关研究中，有文献报道了藁本内酯对C2C12细胞的凋亡和自噬有抑制作用［9-10］，提示了该药物对骨骼肌功能的改善作用，而本研究则首次观察到藁本内酯有明确的提升骨骼肌功能的作用。

在运动情况下，糖原分解产生乳酸，部分进一步氧化为H2O与CO2，未完全氧化的乳酸则进入血液，在运动后会经糖异生途径重新用于糖原合成。检测运动后血乳酸与组织中糖原的水平，对于评价骨骼肌糖异生能力有重要意义。本研究证实，经藁本内酯处理的老年小鼠，运动后血乳酸水平更低，而肌糖原表达更高。这说明藁本内酯的确对骨骼肌的糖异生有促进作用。2种不同给药频率组间乳酸水平有差异，而糖原增加并没有差异，这可能与藁本内酯能够舒张血管有关［11］，局部组织更好的血供有利于乳酸的迅速扩散，使得机体能够以更高的效率清除乳酸。结合GSK-3β检测结果可以发现，不同给药频率下其磷酸化程度均出现了明显的升高。因此，藁本内酯对乳酸的降低可能是加快乳酸扩散与强化糖异生共同作用的结果，因此其变化幅度大于糖原的变化。

最后，本研究检测了藁本内酯对运动老年小鼠血LDH的影响，LDH可用于反映运动引起的组织损伤。在既往研究中，已经观察到藁本内酯对缺血细胞的膜稳定作用［12］，本研究再次在不同模型下验证了藁本内酯对细胞的保护作用。

本研究结果显示，藁本内酯能够提高老年小鼠的力量与耐力，加快乳酸代谢、增强肌糖原合成、抑制力竭运动引起的血LDH升高，改善老年小鼠骨骼肌功能。该作用在藁本内酯中首次发现，拓宽了其生物学用途，也为进一步使用富含藁本内酯的药物改善老年人骨骼肌功能提供了一定依据。