湘西北地区规模化奶牛场犊牛腹泻沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

李淑红 刘勇 孙明兰

摘要：为查明湘西北某规模化奶牛场犊牛腹泻的主要病因，采用细菌培养、平板划线法分离、鉴别培养基分离、革兰氏染色、生化鉴定等方法对细菌进行分离与鉴定;选取28种抗菌药用Kirby-Bauer纸片法进行药敏试验。结果表明，分离出9株沙门氏菌。沙门氏菌对丁胺卡那和头孢他啶敏感，敏感率为7.14%;对庆大霉素和头孢曲松中介，中介率7.14%;对诺氟沙星、红霉素、氧氟沙星等24种药物产生耐药性，耐药率为85.71%。说明沙门氏菌是引起该场犊牛腹泻的主要原因之一，临床上沙门氏菌的耐药性较高，应引起高度重视。

关键词：犊牛腹泻;沙门氏菌;分离鉴定;耐药性

犊牛腹泻的原因较多，分为单纯性腹泻，主要是由于母牛营养不良、犊牛饲养管理不当等引起;细菌性腹泻，主要是由致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等感染引起;病毒性腹泻，主要是由轮状病毒、冠状病毒等引起;寄生虫感染引起的腹泻，主要是由隐孢子虫、贾第虫、球虫等引起[1]。腹泻的犊牛生长发育受阻，如果不及时诊断、治疗，则易导致机体抵抗力下降甚至死亡，给奶牛养殖场造成严重的经济损失[2-3]。

细菌性腹泻中的沙门氏菌（salmonella）是严重危害人类及畜禽健康的主要致病菌之一，各种年龄的动物均可感染，幼年动物感染率高且造成的影响和危害更严重[4]。湘西北地区某規模化奶牛场部分犊牛发生腹泻，为查找病因，减少经济损失，试验对引起犊牛腹泻的细菌进行分离鉴定，并对分离菌株进行药物敏感性试验和耐药性分析，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料来源于2018年11月湘西北地区某规模化奶牛场9头20～40日龄腹泻犊牛。

1.1.2 药品及主要试剂 营养肉汤（NB）、营养琼脂（NA）、伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂（MAC）、亚硫酸铋（BS）琼脂、SS琼脂培养基;肠杆菌科细菌生化鉴定管（11种 10支）;结晶紫、番红、95%乙醇等;丁胺卡那、庆大霉素、诺氟沙星等28种药敏纸片，均购于杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器 垂直净化工作台（SP-DJ），中国上海浦东物理光学仪器厂生产;立式压力蒸汽灭菌器（BXM-30R），上海博迅医疗生物仪器股份有限公司生产;生化培养箱（LRH-150），上海一恒科学仪器有限公司生产;电子天平（BS223S），北京赛多利斯仪器系统有限公司生产[5]。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 用灭菌棉签采取9头腹泻犊牛直肠处新鲜粪样，分别放入有营养肉汤培养基的试管中，做好标记，将试管置于37 ℃恒温箱中培养 18～24 h。

1.2.2 细菌分离鉴定 将增菌培养18～24 h的含病原菌的肉汤样品，分别划线接种于营养琼脂（NA）、伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂（MAC）、亚硫酸铋（BS）琼脂、SS琼脂培养基上，37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察结果。

1.2.3 革兰氏染色镜检 挑取单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察染色结果。

1.2.4 生化试验 取疑是沙门氏菌的菌落接种到肠杆菌科细菌生化鉴定管中，置于37 ℃培养箱中培养18～24 h后观察反应现象，根据沙门氏菌生化反应标准进行结果判定[6]。

1.2.5 药敏试验 采用纸片琼脂扩散法（disc agar diffusion），即Kirby-Bauer法，选用28种抗菌药进行药物敏感性测定[7]，药物敏感性判断标准分为：敏感（S）、中介（I）和耐药（R）3个等级。判定标准参照文献[8]。

2 结果与分析

2.1 细菌在培养基中的形态学观察

营养肉汤（NB）中为均匀浑浊，底部有少量沉淀的菌液。营养琼脂（NA）上菌落颜色为淡黄色，表面光滑、湿润、边缘整齐、凸起、圆形、中等大小。在麦康凯琼脂（MAC）和伊红美蓝琼脂（EMB）培养基中生长为圆形、光滑、边缘整齐无色透明的小菌落。亚硫酸铋（BS）琼脂为灰黑色或灰绿色圆形、光滑小菌落。SS培养基生长出无色半透明、光滑、凸起、多数中心黑色的圆形菌落，符合沙门氏菌菌落生长形态特征[9-10]。沙门氏菌在BS和SS培养基上的菌落形态特征见图1、图2。

2.2 革兰氏染色结果

在油镜（10×100倍）下可见淡粉色、细长、无荚膜、无芽孢的革兰氏阴性（G-）直杆状细菌，符合沙门氏菌特性[10]。

2.3 生化鉴定结果

细菌对靛基质、乳糖、苯丙氨酸、尿素、氨对的反应为阴性;对赖氨酸、硫化氢、卫矛醇、鸟氨酸、枸缘酸盐反应为阳性;对葡萄糖产酸产气。生化反应特性与沙门氏杆菌特征相符[9-10]。

经过细菌培养、分离、菌落形态观察、鉴别培养基培养、涂片革兰氏染色、显微镜观察、生化试验等现象进行判断，共分离出25株细菌，其中9头腹泻犊牛样品分离的9株细菌符合沙门氏菌的特征，分离率为36%，初步确定为沙门氏菌。

2.4 药物敏感性测定结果

分离的9株沙门氏菌对所用28种药物中的丁胺卡那和头孢他啶敏感，敏感率为7.14%;对庆大霉素和头孢曲松中介，中介率7.14%;对诺氟沙星、红霉素、氧氟沙星等24种药物产生耐药，耐药率为85.71%（表1）。

3 讨论与小结

对湘西北奶牛场犊牛腹泻细菌的分离结果表明，共分离25株细菌，其中在9头腹泻犊牛的样本中均分离到沙门氏菌，检出率为100%。结合犊牛腹泻流行病学特点及临床表现，初步确定沙门氏菌是造成该奶牛场犊牛腹泻的主要原因之一。

经调查奶牛场在犊牛发生腹泻病时，使用了泻立停、诺氯沙星等药物进行治疗，但效果不明显。药物敏感试验结果表明，沙门氏菌对诺氯沙星、红霉素等24种药产生耐药性;对丁胺卡那和头孢他啶2种药敏感，对庆大霉素和头孢曲松2种药中介，与2006年喻华英等分离的沙门氏菌对庆大霉素中介[11]相同，对诺氟沙星极敏感、对红霉素中度敏感存在较大差异，主要原因是临床广泛使用抗菌药物防治沙门氏菌病，加之用药不科学不规范，使沙门氏菌的耐药现象日益严重，随着时间的推移，其耐药率大幅上升，耐药谱不断增宽，给我国养殖业和人类健康带来严重威胁[12]。此次试验选用的28种药物中沙门氏菌已对24种抗菌药产生了耐药性，耐药率高达85.71%，10多年前沙门氏菌对诺氟沙星、氧氟沙星等药物现已产生了较强的耐药性，应引起畜禽养殖场的高度重视，因此在临床上对沙门氏菌引起的疾病治疗中应科学合理使用抗菌药，并深入开展沙门氏菌耐药机理的研究，尽可能降低细菌耐药性的产生。

参考文献：

[1]张 勇，李永忠，齐亚银，等. 规模化牛场犊牛常见腹泻症的病原学检测[J]. 今日畜牧兽医，2018，34（10）：5.

[2]李星星，秦陈林，叶鹏宇，等. 犊牛腹泻的病因分析与治疗对策[J]. 当代畜禽养殖业，2018（10）：33.

[3]代少华，李 超，李志骞，等. 奶牛场55例犊牛腹泻主要病原调查[J]. 动物医学进展，2018，39（7）：134-136.

[4]赵春阳，江强世，刘 畅，等. 沙门氏菌检测方法研究进展[J]. 中国奶牛，2018（10）：27-31.

[5]李淑红，张华清，王京仁，等. 湘西北某规模化猪场临床病猪沙门氏菌及大肠杆菌混合感染的病原分离鉴定及耐药性分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，2017（10）：100-102.

[6]陆承平.动物微生物学[M]. 5版.北京：中国农业出版社，2012.

[7]李淑红，王京仁，洪冬胜，等. 犬腹泻病原菌的分离鉴定及药物敏感性分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（4）：170-172.

[8]M100-S14 抗微生物药物敏感性试验执行标准：第14版信息增刊[S]. 美国临床和实验室标准协会，2004.

[9]陆承平. 兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2001：215-216.

[10]周庭银. 临床微生物学诊断与图解[M]. 2版.上海：上海科学技术出版社，2007.

[11]喻华英，胡文兵，贾桂珍，等. 犊牛腹泻病中沙门氏菌的分离与鉴定[J]. 塔里木大学学报，2006，18（1）：10-12，15.

[12]邓 飞，陈 斌，邵 靓，等. 沙门氏菌对常用抗菌药物的耐药机制研究进展[J]. 畜禽业，2018，29（11）：12-13.李慧娥，龙海军，杨 顺，等. 不同配方保鲜液对绣球切花保鲜效果的比较[J]. 江苏农业科学，2020，48（12）：170-174.