绵羊背最长肌组织中TMOD4基因表达差异研究

张鑫 孙洪新 刘月

摘要：研究旨在比较分析不同发育阶段绵羊背最长肌中TMOD4基因的表达水平。采用qRT-PCR和Western-Blot技术检测绵羊1、7、13 月龄3个阶段背最长肌中TMOD4基因mRNA和蛋白质的相对表达量。结果表明，TMOD4的mRNA在1月龄绵羊背最长肌组织中表达量最高，13月龄次之，7月龄较低于13月龄，其中1月龄与7月龄、13月龄之间差异极显著（P<0.01），7月龄与13月龄之间差异显著（P<0.05）。TMOD4蛋白水平在1月龄中最高，7月龄次之，13月龄中最低，1月龄与7月龄和13月龄之间差异极显著（P<0.01），7月龄与13月龄之间差异显著（P<0.05）。结果表明，TMOD4基因与绵羊背最长肌组织发育相关。

关键词：绵羊;TMOD4基因;背最长肌;表达水平

原肌球调节蛋白4（tropomodulin4，TMOD4）基因编码修饰蛋白——TMOD4蛋白在骨骼肌细胞中与肌动蛋白慢速生长末端结合，阻止其延展或聚合，维持肌动蛋白丝的稳定，在原肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用中发挥了重要作用[1]。

TMOD基因家族共有4个亚型，分别是TMOD1、TMOD2、TMOD3和TMOD4[2]。TMOD1主要表达于终分化细胞[3]，TMOD2主要在神经元表达[4]，TMOD3普遍表达[5]，TMOD4在骨骼肌和心脏中高度表达[6]。已有研究表明，TMOD4与TMOD1高度相同，功能相似。TMOD1的过度表达会导致心肌细胞的收缩功能减弱，小鼠上TMOD1的超表达或抑制表达会造成心肌功能异常，转基因小鼠试验发现超表达TMOD1会造成小鼠胚胎的发育异常[7]。有研究显示，在成纤维细胞和成肌细胞中的TMOD1通过减少肌特异性基因的表达而抑制了肌源性分化[8]，表明TMOD1可能在肌源性细胞的分化中起到抑制作用。TMOD4和TMOD1的序列相似并且蛋白功能可相互替换[9]，并且TMOD1大量存在于有纤维分裂后的终末分化细胞中，包括横纹肌、红细胞、晶状体纤维细胞和神经元[4]。

TMOD4是哺乳动物骨骼肌中主要的TMOD亚型，在心肌中的作用与TMOD1相当[10-11]。在非洲爪蟾早期肌纤维细胞中TMOD4基因与肌纤维细胞早期分化高度相关[12]，已有研究证明猪背最长肌中TMOD4参与调控脂肪沉积与肌纤维发育[13-14]。TMOD4基因共有9个外显子和8个内含子，其启动子上游序列有2个结合位点：MEF2A和C/EBPδ，而这2个位点的靶基因分别与肌纤维生长和脂肪分子生成有关，当TMOD4高表达时，促进脂肪沉积，抑制肌纤维发育;低表达时，抑制脂肪生成，促进肌纤维生长[14]。以上研究说明，TMOD4與肉质高度相关，但目前没有任何关于绵羊的TMOD4基因的表达研究，本研究比较不同月龄绵羊背最长肌组织中TMOD4的mRNA和蛋白水平，目的是为TMOD4表达水平与绵羊肌肉发育相关性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

样品来自河北连生农业开发有限公司种羊场，所选试验动物为寒泊羊一代，相同月龄绵羊在相同的饲养管理条件下饲养，满足正常的生长营养需求。选择1月龄、7月龄的公绵羊各3只，13月龄公绵羊2只，于目标日龄当天屠宰，采集8个样品的背最长肌组织，置于液氮中速冻，之后存放于-80 ℃中保存备用。

1.2 主要试剂及仪器

5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）试剂盒（G492，100×20 μL）;EvaGreen 2× qPCR MasterMix-no DYE 荧光定量试剂盒（MasterMix-S，4×1.25 mL）;兔抗人TMOD4多克隆抗体，Affinity Biosciences常州市祥泰生物科技有限公司;鼠抗人GAPDH单克隆抗体;Western试剂盒（内含山羊抗兔及山羊抗鼠IgG）;ND-1000核酸蛋白测定仪;组织蛋白裂解液和 PMSF;BCA蛋白定量试剂盒;微量移液器（Eppendorf，德国）;凝胶成像系统（MiniBis，以色列）;PCR 扩增仪（Bio-Rad，美国）;实时荧光定量PCR仪（罗氏-96，瑞士）;电泳仪（六一生物，中国）;酶标仪（RT-6000 型号）;Western 全自动蛋白分析系统。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取 本试验采用Trizol试剂盒说明书提取绵羊背最长肌的总RNA，DEPC水溶解，电泳检测RNA完整性，测定总RNA的浓度和纯度，调整浓度至500 ng/μL，-80 ℃保存。

1.3.2 引物设计与合成 通过参考文献和查询NCBI数据库选取TMOD4基因的引物序列，内参基因选用GAPDH。所有引物由生工生物工程股份有限公司石家庄分部合成，引物序列见表1。

1.3.3 cDNA合成 总RNA反转录采用5X All-In-One RT Master Mix试剂盒操作说明进行反转录。在200 μL离心管中配制反应液，总体积为 20 μL。反转录体系及条件：RNA Template 2 μg，AccuRT Reaction Mix（4） 2 μL，加无酶水补足至 8 μL。置于PCR仪中42 ℃孵育2 min或室温孵育5 min，取出后置于冰上冷却，加入AccRT Reaction Stopper（5×） 2 μL，5×All-ln-One RT Master Mix 4 μL，无酶水 6 μL，总体积为20 μL。将PCR管短暂离心混匀置于PCR仪中，反应程序为25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。反应完成后取出cDNA产物置于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.4 实时荧光定量PCR 试验全程冰上进行，每个样品设置3个重复。按照Eva Green 2×q PCR Master Mix-no DYE荧光定量试剂盒说明书进行操作（表2、表3），采用罗氏-96荧光定量PCR仪对不同月龄绵羊背最长肌组织内TMOD4基因的相对表达量进行分析，观察扩增的熔解曲线。采用 Excel 软件处理实时荧光定量PCR结果，按照2-ΔΔCT相对定量计算公式，分析绵羊不同月龄背最长肌组织中TMOD4基因 mRNA 的相对表达量。

1.3.5 Western-Blot 采用RIPA蛋白裂解液（强）提取背最长肌组织总蛋白，样品质量与裂解液量的比例为1 g ∶ 10 mL，BCA法测定蛋白浓度。样品的制备方法与传统Western Blot相同，根据Western全自动蛋白表达分析系统说明书进行后续操作。结束后用Western全自动蛋白表达分析软件进行灰度值分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取和qRT-PCR

测定的RNA浓度在1 000 ng/μL左右，D260 nm/D280 nm比值为1.9～2.0。采用1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA条带清晰（图略），28S rRNA和18S rRNA比值接近2 ∶ 1，表明所提取的总RNA质量较好，可用于后续试验。

由图1可知，根据最佳反应体系和反应条件建立内参基因GAPDH和目的基因TMOD4的标准曲线，回归系数（r2）分别为0.993和0.991，斜率分别为-3.231和-3.228，目的基因与内参基因差值均<0.1，说明CT值和模板起始浓度对数值之间具有良好的线性关系，内参基因和目标基因有很高的扩增效率。扩增曲线符合标准的“S”形曲线，目的基因和内参基因的熔解曲线均呈单峰，无非特异性扩增及引物二聚体。

2.2 不同月龄公绵羊背最长肌TMOD4基因mRNA的相对表达量

图2表明，不同月龄对TMOD4基因mRNA相对表达量有极显著影响（P<0.01）。在1月龄表达量最高且极显著高于13月龄和7月龄（P<0.01），13月龄和7月龄之间差异显著（P<0.05）。

2.3 不同月龄绵羊背最长肌TMOD4蛋白相对表达量

采用Western全自动蛋白表达分析系统的Western-blot技术检测不同月龄绵羊背最长肌组织TMOD4蛋白表达量，目的蛋白TMOD4和内参蛋白GAPDH条带清晰，不同月龄间内参蛋白条带面积和灰度基本一致，符合内参蛋白恒定表达的特性。蛋白条带面积和灰度值大小采用Western全自动蛋白表达分析系统自带的分析软件进行分析计算，TMOD4与内参对比，进行半定量分析。由图3和图4可知，月龄的差异对TMOD4蛋白相对表达量有极显著影响（P<0.01）。绵羊在1月龄时，TMOD4蛋白的相对表达量最高，平均值为2.05;13月龄时表达量最低，平均值为0.34。随月龄的增加，绵羊背最长肌TMOD4蛋白相对表达量呈下降的趋势，1月龄最高，与7月龄、13月龄表达量差异极显著（P<0.01）;7月龄次之，与13月龄差异显著（P<0.05）;13月龄最低。

3 讨论

TMOD4是哺乳动物骨骼肌中主要的TMOD亚型，在心肌中的作用与TMOD1相当。TMOD4基因共有9个外显子和8个内含子，其启动子上游序列有2个结合位点：MEF2A和C/EBPδ，而这2个基因分别与肌纤维生长和脂肪分子生成有关，当TMOD4高表达时，促进脂肪沉积，抑制肌纤维发育;低表达时，抑制脂肪生成，促进肌纤维生长[14]。本研究中，绵羊在1月龄时，TMOD4 mRNA表达水平最高，其次是13月龄，最低是7月龄，TMOD4 mRNA水平随月龄增加大幅下降最后趋于平缓略微上升;绵羊在1月龄时TMOD4蛋白水平最高，在7月龄时次之，13月龄最低，TMOD4蛋白水平随月龄增加呈大幅下降趋势且后期趋于平缓。试验所选绵羊为寒泊羊，具有较高的产肉能力，而TMOD4作为参与决定肉质的重要基因之一，表达量趋势可以解读为在绵羊发育早期主要是脂肪沉积抑制肌纤维发育，而中后期则主要促进骨骼肌的发育并且抑制脂肪生成。乔永等研究湖羊不同月龄脂肪沉积发现，在绵羊早期脂肪沉积最快[15]，本研究结果与之相似。

Nworu等对非洲爪蟾胚胎细胞进行原位杂交试驗发现，TMOD4基因在骨骼肌组织早期肌原纤维至关重要，控制骨骼肌发育[16]。TMOD4在终末分化细胞中也大量存在，在横纹肌中，TMOD4与原肌球蛋白协同作用，结合并限制肌动蛋白细纤维尖端肌动蛋白单体交换，在骨骼肌快速收缩中占主导地位。本研究中TMOD4在早期绵羊背最长肌组织中表达量最高，为肌纤维发育和骨骼肌的生长做准备，并且羔羊活泼好动，骨骼肌收缩迅速，所以此阶段绵羊TMOD4表达量最高。随着月龄增加，绵羊骨骼肌发育完全，肌纤维粗壮，肌间脂肪减少，活动减少，TMOD4表达水平降低。

本研究初步探讨了TMOD4在绵羊不同月龄间的表达差异和大体趋势，相关TMOD4对肉质品质的影响还有待于进一步研究。

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