miR-486-5p的靶基因预测及其在胰腺腺癌中作用的生物信息学分析

任天宇，周新童，党胜春

（江苏大学附属医院 普通外科，江苏 镇江 212001）

胰腺癌是癌症相关性死亡的主要原因之一，是消化系统恶性程度最高的肿瘤，其主要病理类型为胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），5年生存率约为5%[1-2]。由于胰腺癌起病隐匿，早期症状不典型，大多数患者确诊时已属晚期，预后较差。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一种内源性的非编码小RNA，其作为天然的调控分子在细胞增殖分化、凋亡、代谢、微血管形成及肿瘤的发生等生物过程中发挥重要的作用[3]。研究发现，miRNA不仅可以作为诊断和预后生物标志物，还可以用作潜在的治疗靶标[4-5]。

miR-486-5p 是一种新发现的非编码单链RNA，有研究显示miR-486-5p在多种肿瘤，如甲状腺乳头状癌[6]、结直肠癌[7]及肺癌[8]等肿瘤组织中的表达显著低于正常组织，表明其作为一种抑癌因子可抑制肿瘤细胞的增殖、转移和浸润，并通过靶向调节下游的靶基因和信号通路而影响肿瘤的发生发展。然而，有关miR-486-5p在胰腺癌中的作用及调控机制研究甚少。

本研究运用生物信息学方法，研究miR-486-5p对PAAD患者预后的影响，同时综合运用多个数据库预测并筛选其调控的下游靶基因，同时对靶基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集、京都基因和基因组途径百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，查找其可能存在的生物学功能，再通过蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析，筛选出PPI网络中的核心靶基因，并在公共数据库进一步验证筛选出核心基因。这将有助于更深入地研究miR-486-5p在PAAD发生发展中的作用，评估miR-486-5p在PAAD中的临床意义和诊断价值，为研究PAAD发生、发展的作用和相关调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 miR-486-5p 在PAAD 中的生存分析

PROGmiRV2[9]公共数据库包含不同类型癌症的miRNA的预后数据。使用PROGmiRV2比较了miR-486-5p高表达和低表达PAAD患者的总体生存期。

1.2 miR-486-5p 靶基因的预测

使用在线靶基因预测工具DIANA tools[10]、HOCTAR[11]、miRDB[12]、Target Scan[13]、star Base[14]共5 个数据库按照默认参数预测靶基因，并绘制韦恩图，筛选出至少在3个数据库中都存在靶向关系的基因用于后续分析。

1.3 GO 富集分析与KEGG 信号通路分析

DAVID[15]（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）生物信息数据库整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息。将靶基因上传到DAVID数据库中，通过富集注释，最终得到靶向基因及所参与的相关信号通路。以P＜0.05为阈值，得到统计学上有意义的GO注释项和KEGG信号通路。

1.4 PPI 网络构建和关键基因筛选

使用STRING[16]数据库构建miR-486-5p靶基因的PPI网络，为了探索功能性蛋白质相互作用网络，通过Cytoscape软件将其可视化，然后使用MCODE插件基于拓扑结构找到PPI中最密集连接的区域，从而识别miR-486-5p的关键靶基因。

1.5 关键基因的表达验证及生存分析

GEPIA[17]在线工具包括了多种癌症患者的TCGA和GTEx存活数据，通过GEPIA评估miR-486-5p 的关键靶基因的临床预后意义，绘制Kaplan-Meier生存曲线，P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-486-5p 在PAAD 中的生存分析

通过在PROGmiRV2中比较miR-486-5p在PAAD中高低表达生存数据，可以发现在肿瘤组织中高表达患者的总体生存时间优于低表达患者（P＜0.05），从而认为miR-486-5p可作为PAAD的一种潜在的预后生物标志物（图1）。

图1 PROGmiRV2 中miR-486-5p 表达对PAAD 患者总生存率的影响Figure 1 The influence of miR-486-5p expression on overall survival in PAAD patients from PROGmiRV2

2.2 miR-486-5p 靶基因预测

利用DIANAtools、HOCTAR、miRDB、TargetScan、starBase 5个在线数据库筛选出的靶基因数目分别为557、409、332、167、757，取并集共得到1 540个基因，对上述结果绘制Venn图（图2），得到至少被3个数据库预测到的靶基因数目共187个。

图2 miR-486-5p 的预测靶基因个数Figure 2 Number of the predicted target genes of miRNA-486-5p

2.3 靶基因功能和通路途径分析

利用DAVID在线数据库对预测的靶基因进行GO功能富集以及KEGG信号通路分析，发现靶基因涉及蛋白质稳定、蛋白质磷酸化、RNA聚合酶II启动子的转录正调节及凋亡过程的负调节等生物学过程，富集在细胞质、核质及细胞膜等细胞组分（表1）。通过KEGG信号通路分析发现基因主要参与FOXO信号通路、p53信号通路、Ras信号通路和PI3K-Akt等信号通路（表2）。

表1 miR-486-5p 预测靶基因的GO 富集分析Table 1 GO enrichment analysis of the predicted target genes of miR-486-5p

表2 miR-486-5p 预测靶基因KEGG 信号通路分析Table 2 KEGG pathway analysis of the predicted target genes of miR-486-5p

2.4 PPI 网络分析

为了研究靶基因在PAAD中的作用机制，应用STRING数据库对miR-486-5p靶基因构建PPI网络图并将其可视化（图3），发现了一些在PAAD调控中起关键作用的基因，如SIRT1、PTEN、SMAD2、CSNK2A1及SERPINE1等。

图3 miR-486-5p 靶基因PPI 网络构建Figure 3 The PPI network constructed with the target genes of miR-486-5p

2.5 GEPIA 核心基因验证及生存分析

在GEPIA数据库中分析关键基因发现，CSNK2A1和SERPI NE1水平在PAAD组织表达中高于正常胰腺组织，差异有统计学意义（均P ＜0.05）（图4）。生存分析发现CSNK2A1和SERPINE1基因的表达量与患者的总体生存时间和无病生存时间均密切有关（均P＜0.05）（图5）。

图4 CSNK2A1 和SERPINE1 在PAAD 组织及正常组织中的表达差异Figure 4 Differential expressions of CSNK2A1 and SERPINE1 in PAAD tissues and normal tissues

图5 CSNK2A1 和SERPINE1 与PAAD 患者预后的关系Figure 5 Relations of CSNK2A1 and SERPINE1 with the prognosis of PAAD patients

3 讨 论

PAAD是恶性程度最高的消化道肿瘤之一，其发病率与致死率近乎持平[18]，手术切除是唯一可能根治的治疗方法，近年来尽管胰腺癌的外科治疗取得了长足的进步，围手术期病死率和术后并发症发生率均显著下降，但其手术切除率和远期疗效仍不尽人意[19]。提高PAAD早期确诊率、找出分子标志物以改善PAAD的治疗效果是目前急需解决的问题。

miRNA作为转录后参与基因调控的小型非编码RNA家族，现被公认为是各种癌症的重要干预目标和预测工具。目前已有多项研究发现miRNA在PAAD中的重要作用及机制[20-22]。miR-486-5p是一种新发现的非编码单链RNA，最近有研究[23]发现，血清中的miR-486-5p可作为宫颈癌的诊断标志物，Mohamed等[24]发现miR-486-5p在低表达肺癌中预后较差，并与分期显著相关，可作为肺癌的诊断和预后标志物。尽管miR-486-5p在癌症上具有如此多的功能，尚缺乏miR-486-5p在PAAD中的研究报告。

为了更好地了解miR-486-5p的生物学功能，本研究发现miR-486-5p在肿瘤组织中高表达患者的总体生存时间优于低表达患者（P＜0.05），结果表明miR-486-5p低表达是导致PAAD患者不良预后的因素。

本研究综合多个靶基因预测工具筛选miR-486-5p的靶基因，进一步对得到的靶基因进行功能分析，发现其主要参与蛋白质稳定、蛋白质磷酸化、RNA聚合酶II启动子的转录正调节及凋亡过程的负调节等生物学过程，同时显著富集在FOXO信号通路、p53信号通路、Ras信号通路及PI3KAkt等信号通路，表明miR-486-5p通过多基因及多途径影响胰腺癌的发生发展。

对靶基因蛋白网络的分析，本研究筛选出SIRT1、PTEN、SMAD2、CSNK2A1及SERPINE1等多个关键基因，其中PTEN[25]、SMAD 2[26]、SIRT1[27]已被证实作为miR-486-5p的靶基因导致癌症的进展。通过GEPIA数据库进一步验证关键基因，我们发现CSNK2A1和SERPINE1表达水平在PAAD组织显著高于正常胰腺组织。其中CSNK2A1被证明[28]可以通过介导SIRT6磷酸化参与乳腺癌的进展，是乳腺癌预后不良的指标。根据功能分析结果，我们可以推测它可能通过磷酸化蛋白质参与胰腺癌的进展。有研究[29]发现SERPINE1属于丝氨酸蛋白酶抑制剂的一类，主要参与调节细胞迁移、侵袭以及耐药[30-32]。生存分析发现CSNK2A1和SERPINE1基因的表达量与患者的总体生存时间和无病生存时间均密切相关（P＜0.05），这表明它们对PAAD患者的预后有着不良的影响，可作为胰腺癌的潜在治疗靶点以改善预后。

总之，本研究查找了miR-486-5p的靶基因以及其激活的相关信号通路，这些发现有助于更好地理解PAAD中潜在的生物学机制。癌组织中miR-486-5p低表达患者的总体存活率可为PAAD诊断和治疗提供依据。同时本研究筛选的基因也为PAAD的早期诊断与分子治疗提供了潜在的标志物和靶点。虽然本研究获得了一些有意义的见解，但仍存在一些局限性，如样品来源不同，数据库中miR-486-5p在PAAD表达作用仍然不明确。因此，需要更深入的体内或体外实验研究来验证miR-486-5p在PAAD中的作用及机制。