四种特殊染色在泪道放线菌感染诊断中的应用

杨琦 毕颖文 蔡蓉蓉

摘要：目的  探讨六胺银、PAS、革兰染色和抗酸染色4种特殊染色在泪道放线菌感染诊断中的应用。方法  收集2010年12月～2019年6月复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科收治的泪道放线菌感染患者30例，分析该病六胺银、PAS、革兰染色、抗酸染色4种特殊染色方法的镜下表现。结果  常规HE染色镜下下可见散在菌落样结构，菌丝结构不清，染色浅淡;六胺银、PAS和革兰染色3种特殊染色方法，镜下均可见放线菌分别呈棕黑色、紫红色和紫蓝色，呈阳性染色;并于低倍镜下可见放线菌菌落呈典型的菊花样外观，高倍镜下可见放线菌菌丝。抗酸染色示，镜下所有组织细胞均呈蓝色，无特异性呈阴性染色。结论  六胺银、PAS、革兰染色及抗酸染色的联合应用有助于泪道放线菌感染的诊断及鉴别诊断。

关键词：泪道炎;放线菌;六胺银;PAS革兰染色;抗酸染色

中图分类号：R777.2                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.055

文章编号：1006-1959（2020）11-0168-03

Abstract：Objective  To explore the application of four special stains of hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain in the diagnosis of lacrimal actinomycete infection.Methods  A total of 30 patients with lacrimal actinomyces infection admitted to the Department of Ophthalmology， Otolaryngology and Affiliated Hospital of Fudan University from December 2010 to June 2019 were collected， the microscopic performance of the disease with four special staining methods including hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain was analyzed.Results  Under the conventional HE staining microscope， scattered colony-like structures can be seen， the mycelium structure is unclear， and the staining is light; There are three special staining methods for hexaamine silver， PAS and Gram staining， and the actinomycetes can be seen under the microscope as brown-black， purple-red and purple-blue， with positive staining; The actinomycete colonies can be seen under a low magnification lens with a typical chrysanthemum-like appearance， and the actinomycete hyphae can be seen under a high power microscope. Acid-fast staining showed that all tissue cells were blue under the microscope， and there was no specific negative staining.Conclusion  The combined application of hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain is helpful for the diagnosis and differential diagnosis of lacrimal actinomycete infection.

Key words：Lacrimal inflammation;Actinomycetes;Hexaaminesilver;PAS Gram stain;Acid-fast stain

淚道感染（lacrimal duct infection）是眼部常见的炎症性病变，主要症状为溢泪，粘性或脓性分泌物及结膜充血，常见的致病菌为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，常规采用泪道冲洗并配合抗生素滴眼液治疗。泪道放线菌感染比较少见，临床表现同泪道细菌感染相似，仅泪道冲洗及抗生素治疗效果常无效，须经泪道切开，将放线菌形成的小菌落即硫磺颗粒取出，再行注药并配合抗生素滴眼液治疗。因此精确的诊断对患者的后续治疗至关重要。放线菌属于放线菌属[1]，常寄生于人体的口腔、扁桃体隐窝、上呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道等多个器官或组织，是一种条件致病菌，当身体抵抗力降低时或条件适合其生长时，便明显增殖，出现临床症状，导致局部组织的化脓性炎症[2]。在培养基上培养放线菌，其形态结构难与真菌相鉴别，因此，组织病理检测及其特殊染色对于放线菌的诊断尤为重要。本研究通过分析我院30例泪道放线菌感染病例，分析六胺银、PAS、革兰染色和抗酸染色四种特殊染色诊断泪道放线菌感染的特点，以期为指导临床治疗提供参考，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料  收集2010年12月～2019年6月复旦大学附属眼耳鼻喉科医院30例眼科收治的诊断结果为泪道放线菌感染病例。其中女24例，男6例;年龄39～85岁，平均年龄64.6岁;左眼9例，右眼13例，双眼1例，左右眼情况不详7例。最常见入院症状为流泪，溢泪增多，其次为粘液样分泌物伴黄白色分泌物和流脓，部分伴有眼红眼痛和异物感。患者行泪道切开术后见放线菌颗粒，亦称硫磺颗粒，常规病理送检，并进行HE染色和六胺银、PAS、革兰染色、抗酸染色四种特殊染色。

1.2方法  患者行泪道切开术取出放线菌形成的小菌落样结构即硫磺颗粒，并送检，标本经10%福尔马林固定，经梯度脱水和梯度透明后浸蜡包埋，并制成厚度为4 μm的白片各5张。并分别进行常规HE染色和六胺银、PAS、革兰染色、抗酸染色四种特殊染色（所有试剂盒均来源于珠海贝索公司）。

1.2.1 HE染色  操作方法：①切片常规脱蜡至水;②58 ℃热苏木素染色2～3 min后流水冲洗。③盐酸酒精分化2～3 s，流水冲洗;④温水10 s返蓝;⑤95%酒精浸泡2 min;⑥直接入醇溶性伊红染液15～30 s;⑦梯度脱水透明，中性树胶封固。

1.2.2六胺银染色  操作方法：①工作液配置：50 ml硼砂溶液+0.5 g六次甲基四胺银粉剂，用力摇匀5～10 min，再将六次甲基四胺银液全部倒入硼砂溶液中，重复此步骤3次，确保六次甲基四胺银内粉剂被充分溶解;②将切片常规脱蜡至水;③将高碘酸滴到玻片上充分覆盖组织并氧化10分钟后蒸馏水冲洗2 min;④将冲洗好的玻片放入装有染色液的试剂缸中，再放到盛有60 ℃热水的容器瓶并置于85 ℃烘箱中约20～30 min，直至切片在黄棕色的背景中见到黑棕色反应，如果颜色不够深可以再放回染色液中。⑤硫代硫酸钠处理3 min，水洗;⑥伊红复染30 s;⑦常规脱水透明，中性树胶封固。

1.2.3 PAS染色操作方法  ①常规脱蜡至水;②将高碘酸滴到玻片上充分覆盖组织并氧化10 min，水洗;③将雪夫试剂滴到玻片上并充分覆盖组织，染色10～15 min，水洗;④苏木素液染核2 min;⑤常规脱水透明，中性树胶封固。

1.2.4革兰染色  操作方法：①常规脱蜡至水;②滴加龙胆紫液染10～15 s，水洗;③玻片滴加碘溶液，并充分覆盖组织，染色10～15 s，水洗;④加脱色液（丙酮、乙醇）脱色20～30 s，水洗;⑤沙黄溶液复染15 s，水洗;⑥常规脱水透明，中性树胶封固。

1.2.5抗酸染色  操作方法：①常规脱蜡至水;②滴加石炭酸复红染液盖满玻片;染色10～15 min，水洗;③滴加酸性酒精溶液，脱色1～2 min，直至组织无可视红色为止，水洗;④滴加亚甲基蓝溶液于玻片上并充分覆盖组织，染色2 min，水洗;⑤常规脱水透明，中性树胶封固。

2结果

HE镜下可见急慢性炎细胞浸润，出血，部分可见嗜伊红无结构分泌物，并均可见散在的中间蓝色，周围红色，颜色浅淡的菌落样结构，见图1;六胺银染色：30例组织镜下均见菌落及菌丝呈黑棕色，菌落呈菊花样外观。背景棕黑色，对比鲜明，见图2;PAS 染色：30例组织镜下均见菌落及菌丝呈紫红色，菌落呈菊花样外观，对比鲜明，见图3;革兰染色  30例组织镜下均见紫蓝色菌丝及菊花样菌落结构，见图4;抗酸染色：30例组织均呈阴性（镜下所有组织均呈蓝色），见图5。

3讨论

放线菌为革兰阳性厌氧或微需氧菌，生长缓慢，无芽孢，致病菌多为衣氏放线菌[3]。放线菌感染多为慢性无痛性，常伴有多发瘘管形成，可排出黄色硫磺颗粒，将硫磺颗粒置于玻片上，盖上盖玻片，轻轻压平后显微镜检查，可见颗粒呈菊花状，由棒状长菌丝呈放射状排列[1]。本研究发现泪道放线菌感染临床并不常见，其主要症状包括溢泪、粘性及脓性分泌物，因临床症状不典型，易被误诊，临床需注意与功能性溢泪、泪囊憩室、泪囊囊肿和结膜炎相鉴别。在泪小点或泪道处出现“硫磺颗粒”（结石样物）这一现象是泪道放线菌感染的特征性的病理改变[5]，常由患者机体抵抗力下降后内源性感染引起。本研究中老年的女性居多可能与该年龄段患者抵抗力相對较差有关。

放线菌菌培养的阳性率较低，仅在50%左右，病理诊断是放线菌诊断的金标准[6]。以往关于放线菌病理诊断及鉴别诊断方面的研究仅为一种或两种特殊染色的个例或小样本的系列研究，本组是四种特殊染色联合应用的较大的样本研究。泪道放线菌感染送检标本的常规HE染色结果，镜下可见急慢性炎细胞浸润，有的可见嗜伊红均质分泌物，并可见散在菌落样物，但菌落及菌丝染色浅淡，缺乏特异性，不仅观察困难，而且容易漏诊。此外，六胺银染色能够对放线菌及其菌落进行很好的染色，对比清晰，低倍镜下，放线菌菌落呈典型的菊花样结构，高倍镜下可见黑棕色菌丝呈放射状排列，对诊断结果至关重要，缺点是耗时长，同时工作液不能接触金属离子，所以冲洗液最好选用蒸馏水，同时高碘酸冲洗要充分，避免造成严重背景色，并且染色时间不好掌握，容易过染，耗材贵。本组PAS染色，放线菌菌落呈菊花样外观，菌丝呈紫红色，耗时短，操作简单，是准确性高，时效性好的特殊染色方法。本组革兰染色，放线菌呈紫蓝色，主要用于同革兰阴性菌相鉴别。临床上，大多数放线菌的革兰染色只用于细胞涂片或者细菌培养后的特殊染色。从组织学角度对组织内的放线菌进行革兰染色，得到了同样好的染色结果。本组抗酸染色的主要作用在于将放线菌与麻风杆菌和结核杆菌相鉴别，也佐证了放线菌呈抗酸染色阴性。因此在常规HE下发现中间蓝色，周围红，染色浅淡的菌落样结构，并配合四种特殊染色的染色结果，即在六胺银、PAS、革兰染色中，低倍镜下观察到典型的菊花样外观的菌落及高倍镜下看到杆状菌丝呈放射状排列并呈阳性着色;同时抗酸染色看不到阳性着色即可诊断为放线菌感染。

本组关于泪道炎放线菌感染与其他菌群相鉴别的研究发现，泪道炎的致病菌按革兰染色结果和形态可分为革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌、革兰阴性球菌和革兰阴性杆菌以及真菌和放线菌。①放线菌与革兰阴性菌（革兰阴性球菌和革兰阴性杆菌）相鉴别：放线菌为革兰阳性菌，利用革蘭染色结果，可将其与革兰阴性菌相鉴别。②放线菌与革兰阳性菌（革兰阳性球菌和革兰阳性杆菌）相鉴别：泪道感染中革兰阳性球菌较为常见，多见表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌;革兰阳性杆菌较少见，偶见假白喉棒状杆菌[4];因金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和假白喉棒状杆菌菌体太小在常规HE下难以发现，即使看到也是极小的点状结构;同时它们的六胺银及PAS染色分别呈棕黄色和粉色背景色，呈阴性表达。结合特殊染色可以与放线菌相鉴别。表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌诊断主要靠细菌培养。假白喉棒状杆菌的鉴定主要依靠细菌培养、革兰染色和生化实验;③放线菌与真菌相鉴别：泪道炎常见的真菌为白假丝酵母菌。白假丝酵母菌为革兰染色阳性真菌，同时六胺银和PAS也均呈阳性，抗酸为阴性，但是其镜下结构完全不同，放线菌菌丝纤细0.1～0.5 μM 菌落呈放射状，六胺银和PAS染色后镜下可见典型的菊花样菌落结构。在组织切片中，白假丝酵母菌主要位于黏膜表面的渗出物及坏死组织内，菌体呈球形或卵圆形，直径为3～6 μM，形成芽生孢子，孢子伸长成芽管（内有空泡样结构），不与母体脱离，继而形成假菌丝。后者常带有球状成堆的芽生孢子，菌丝内有核，可见分隔、分枝，也见厚膜孢子[7]。

综上所述，六胺银、PAS、革兰染色及抗酸染色结果结合常规HE对放线菌的诊断及鉴别诊断有重要作用。

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收稿日期：2020-02-27;修回日期：2020-04-18

编辑/冯清亮