外源褪黑素对干旱胁迫下樟子松的缓解效应

赫传杰

（国家林业和草原局 森林和草原病虫害防治总站，沈阳110034）

随着现代林业的发展，要求在造林时提高苗木的质量来抵御不良环境对苗木生长的影响。在众多环境胁迫中，干旱是影响树木生长和产量的重要因素[1-4]。干旱胁迫极易引起吸收光能过剩，显著降低植物叶片光合色素含量和叶片相对含水量，加强活性氧（ROS）的积累和膜脂质过氧化程度[5-7]。因此，在苗木造林之后，如何避免苗木遭受干旱胁迫显得尤为重要。近年来的研究表明，褪黑素（melatonin）能够提高植物抗逆性[8-10]，而这些功能逐渐受到学界的重视。褪黑素是广泛存在于动植物体中的一种保守小分子物质，其主要功能是高效清除自由基，这对缓解干旱诱导的过氧化对植物造成的损伤具有重要意义[11]。目前已经开展了许多外源褪黑素调节植物生长发育和抗逆性及抗氧化方面的研究。WANG等[12]研究表明，长期在土壤中添加100μmol·L-1褪黑素延迟了干旱诱导的苹果（Malus pumila）叶片衰老。也有研究表明，褪黑素处理加强了干旱胁迫下番茄幼苗的光合性能并提高了抗氧化能力[13]。但这些研究多集中在园艺作物和农作物方面，如番茄（Lycopersicon esculentum）、苹果（M.pumila）、小麦（Triticum aestivum），在林业生产方面的应用还未见相关报道。基于此，开展应用外源褪黑素调节干旱胁迫下苗木抗逆性的研究具有重要的理论和实践意义。

本研究以辽西北干旱-半干旱地区的主要造林树种樟子松（Pinussylvestris var.mongolica）为研究对象，在苗期人工设置自然干旱和正常水分处理，研究干旱胁迫下褪黑素对樟子松苗木生长、光合及抗氧化特性的影响，并明确其提高樟子松抗旱能力的作用途径，以期为深入探索褪黑素提高樟子松抗旱性作用的机制提供参考，也为褪黑素应用于林业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将供试种子用0.5%高锰酸钾消毒30min，清水冲洗数次后，用灭菌湿纱布包裹保湿,置于人工气候箱中，25℃下催芽，每天早晚用无菌水各冲洗1次，直至出芽。将草炭土、蛭石和河沙按2∶1∶1的比例配制混合土，置高温高压灭菌器中121℃下灭菌2h，装入营养钵（直径15cm×高13cm）中。于2017年4月将经催芽的樟子松种子播入营养钵中，每钵30颗，上覆2cm厚无菌土，浇透水后放入大棚中培养，待幼苗出土后，定苗至每钵20株。

1.2 试验设计

待苗木长势一致时，对苗木进行相应处理。预试验表明，对苗木针叶喷施50mL 100μmol·L-1褪黑素时，苗木的生长状态最好，因此本研究选用褪黑素浓度为100μmol·L-1，喷洒量为50mL。喷施以针叶滴水为准，对照组为针叶喷施等量的清水，早晚各处理1次，连续处理3d后将植株移至温室中，采用称重法进行控水试验，使土壤含水量维持在 35%～40%。 共设置 4种处理方式：(1)正常水分（W）；(2)正常水分+褪黑素（W+T100）；(3)干旱胁迫（D）；(4)干旱胁迫+褪黑素（D+T100）。干旱处理的第10天测定相关指标。每个处理5次重复。

1.3 相关指标测定

1.3.1 苗木生长指标测定 干旱胁迫处理之后，进行正常管护，继续生长10d进行取样，每个处理随机抽取生长健壮的樟子松苗木5株，每个处理3次重复。用直尺和游标卡尺测定苗木的苗高和地径，用天平称量苗木鲜重，然后将苗木放入85℃的烘箱中，烘干至恒重，称量苗木的干重。

1.3.2 苗木光合色素含量测定 采用丙酮研磨法，准确称取樟子松针叶0.5g，加入10mL丙酮，冰浴研磨，吸取上清液，10000 r·min-1离心5min，留上清液。利用分光光度计分别测定各处理在663nm和645nm处的光吸收值A663和A645。每个处理3次重复。

1.3.3 苗木抗氧化保护酶活力测定 准确称取樟子松针根、茎、针叶各0.1g，液氮研磨，按质量体积比加入pH值7.0 的 50 mmol·L-1冷磷酸缓冲液 10mL，4℃、10000 r·min-1低温离心 20min，上清液即为酶液。 CAT、POD、PPO、TSOD、Cu/Zn-SOD和APX采用南京建成公司的酶活试剂盒测定。

1.3.4 苗木可溶性蛋白和丙二醛（MDA）含量测定 准确称取樟子松针根、茎、针叶各0.5g，加入10mL蒸馏水，冰浴研磨，吸取上清液，10000r·min-1离心5min，留上清液。每个处理3次重复。采用考马斯亮蓝G250法测定可溶性蛋白含量，用南京建成公司试剂盒测定MDA含量。

1.4 数据处理

所得数据用SPSS13.0进行单因素差异显著性分析（ANOVA），并使用Graphpad Prism 7.0绘图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下外源褪黑素对苗木生长的影响

正常水分条件下，褪黑素对樟子松苗木的高生长没有显著影响（p＞0.05）（图1A）。与正常水分处理相比，干旱胁迫可以显著抑制樟子松苗木的高生长（p＜0.05），然而这种抑制作用在施用100μmol·L-1褪黑素处理后得到有效缓解，干旱胁迫下，施用褪黑素处理的苗高比不加褪黑素处理提高5.5%，基本达到正常水分条件下的水平。正常水分条件下，施用外源褪黑素可以显著促进樟子松苗木的径向生长（p＜0.05），施用褪黑素处理组（W+T100）的地径在试验结束时达到0.10cm，比W处理组提高25%，且达到显著差异水平（p＜0.05）。干旱胁迫下，外源褪黑素可以有效缓解因干旱对苗木造成的生长抑制，可以促进苗木径向生长，施用褪黑素处理组（D+T100）的地径与干旱未施加褪黑素处理组（D）的地径虽没有达到显著差异水平（p＞0.05），但其数值却比D处理组提高12.5%，且与正常水分条件下未加褪黑素处理组（W）的地径大致相同。苗木的生长与物质积累是具有一定关联的。理论上，苗木长的越高大，生物量就越高。但也有特殊情况，如苗木由于肥力过大因素，造成徒长，虽然高生长很迅速，但干物质的积累却出于较低的水平。本研究中，外源褪黑素在苗木干重方便表现的最为显著（图1D）。施加外源褪黑素后，苗木无论是正常水分还是干旱胁迫下，其干重增加量均与同等条件下未施加褪黑素处理组达到显著差异水平（p＜0.05）（图 1D）。

2.2 干旱胁迫下外源褪黑素对苗木光合色素的影响

光合色素含量的高低，直接决定着植物光合作用的强弱，进而决定植物生长的好坏。本研究中，与不施加褪黑素相比，各施加外源褪黑素处理组（W+T100和D+T100）均可有效提高苗木针叶当中叶绿素a含量（图2A）。与叶绿素a结果不同的是叶绿素b，正常水分条件下，施加外源褪黑素反而会降低苗木叶绿素b的含量，而当苗木受到干旱胁迫，苗木叶绿素b的含量在褪黑素的作用下反而又升高，高于未施加褪黑素处理组22.3%，且达到显著差异水平（p＜0.05）。

2.2 干旱胁迫下外源褪黑素对苗木抗氧化酶的影响

由图3A～图3C可知，无论正常水分条件还是干旱胁迫条件下，施加外源褪黑素均能显著提高樟子松苗木根、茎、叶内的POD活性（p＜0.05）。外源褪黑素的施用，可以有效缓解苗木因干旱胁迫带来的生理活性抑制，根部表现尤为明显（图3A），干旱胁迫施加褪黑素处理组（D+T100）的根部POD活性可达2.4U·mgprot-1，比不施加褪黑素处理组提高50%。

由图3D～图3F可知，褪黑素在樟子松苗木的茎内表现最为显著，干旱胁迫条件下，施加褪黑素处理组苗木（D+T100）茎内的PPO活性为44.8U·mgprot-1，比不施加褪黑素处理组（D）提高44.5%，达到显著差异水平（p＜0.05）。 在根和叶内，褪黑素处理没有使PPO活性达到显著差异水平（p＞0.05）。

图1 不同处理苗木的生长指标Figure 1 Growth parameters of different treatments

图2 不同处理苗木光合色素含量Figure 2 Photosynthetic pigment of different treatments

由图3G～图3I可知，与PPO活性变化规律相似，干旱处理组CAT活性均高于正常水分处理组。与PPO变化规律不同的是，干旱胁迫下，与未施加褪黑素处理组相比，CAT在苗木的叶部达到显著差异水平（p＜0.05），在根和叶内，施用褪黑素可以有效提高CAT活性，但与未施加褪黑素处理组相比未达到显著差异水平（p＞0.05）。正常水分条件下，根、茎、叶内的CAT活性均未达到显著差异（p＞0.05），这一现象与PPO变化规律相同。

由图4A～图4C可知，干旱胁迫可以诱导樟子松苗木T-SOD活性的升高。正常水分条件下，樟子松苗木根和茎内的T-SOD活性均有小幅度的提高较低，且均没有达到显著差异水平（p＞0.05），但在叶部，T-SOD活性较高，说明褪黑素在单纯影响樟子松苗木T-SOD方面作用较弱，必须在外加胁迫条件下，方能产生作用。在叶部，干旱胁迫未加褪黑素处理组（D）的T-SOD活力水平与正常水分条件下无显著差异（p＞0.05），但施加褪黑素后，T-SOD活力水平大幅度上升，达到580 U·g-1，比未加褪黑素处理组（D）提高31.8%，达到显著差异水平（p＜0.05）。干旱胁迫下，苗木由于受到过氧化损伤，致使体内T-SOD活力提高，缓解氧化损伤，度过难关。本研究中，褪黑素的施加可以从一定程度上增强苗木产T-SOD的能力，这种“增强效应”在叶部表现尤为突出。

由图4D～图4F可知，干旱胁迫下，褪黑素对苗木Cu/Zn-SOD活力的“增强效应”主要表现在叶部。在苗木叶部，与未施加褪黑素处理组（D）相比，施加褪黑素处理组（D+T100）Cu/Zn-SOD活力达到488U·g-1，比未加褪黑素处理组（D）提高43.5%，该组酶活的提高幅度较大，且达到显著差异水平（p＜0.05）。

图3 不同处理苗木的POD、PPO和CAT活性Figure 3 Activities of POD,PPO and CAT of different treatments

图4 不同处理苗木的T-SOD、Cu/Zn-SOD和APX活性Figure 4 Activities of T-SOD,Cu/Zn-SOD and APX of different treatments

由图4G～图4I可知,干旱胁迫下，施加褪黑素对苗木根和茎中APX活性具有明显的促进作用。在根和叶部，施加褪黑素处理组（D+T100）APX活力达到0.98 U·g-1，比未施加褪黑素处理组（D）分别提高22.5%和19.5%，均达到显著差异水平（p＜0.05）。

2.3 干旱胁迫下外源褪黑素对苗木丙二醛（MDA）的影响

由图5可知，干旱胁迫下，樟子松苗木根、茎、叶中的MDA含量均有大幅升高，而正常水分条件下的MDA水平均无明显变化。本研究当中，干旱胁迫下施加褪黑素处理组（D+T100）的MDA含量均高于正常水分条件，表明苗木虽施加褪黑素，但还是受到一定程度的胁迫损害，但褪黑素可显著降低苗木根、茎、叶中的MDA含量，缓解干旱胁迫对苗木的伤害，且下降幅度均达到显著差异水平（p＜0.05）。

图5 不同处理苗木的MDA含量Figure 5 Content of MDA of seedlings

2.4 干旱胁迫下外源褪黑素对苗木可溶性蛋白的影响

由图6可知，无论正常水平还是干旱胁迫下，施加褪黑素均能提高樟子松苗木根、茎、叶中可溶性蛋白含量，但这种提高幅度有限，均未达到显著差异水平（p＞0.05）。提高幅度最大的为叶部，其次为根部。该结果表明，施加褪黑素可以在一定程度上提高苗木可溶性蛋白的含量，但作用较弱，具体原因有待于进一步研究探讨。

图6 不同处理苗木的可溶性蛋白含量Figure 6 Content of soluble protein of seedlings

3 讨论与结论

干旱环境对植物体生长、生理代谢以及形态建成具有较大影响。自然条件下，植物经常会遭遇水分不足等情况。在辽宁西北部地区的干旱-半干旱地区，樟子松作为防风固沙的主要造林树种，其面临的干旱环境是十分恶劣与严重的，如何深入挖掘其耐旱性，或者说通过适当的人工干预，使其在苗期的干旱耐受性显著增强，则可以大幅提高其在干旱地区的成活率，服务于当地的林业生态建设。

褪黑素是一种吲哚类色胺，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，广泛存在于动植物中[14]。到目前为止，大多数有关褪黑素的研究主要集中于其在植物组织（尤其是园艺作物）中含量的检测和积累规律的分析，近些年关于其在植物中的合成与分解、生理功能以及作用机理的研究已成为热点。褪黑素的抗氧化能力高于抗坏血酸、谷胱甘肽等抗氧化剂，通过与自由基的级联互作，一个褪黑素分子可以清除10个活性氧（ROS）分子，通过这种机制来使植物抵御由环境胁迫引发的活性氧[15-16]。有研究表明，利用100μmol·L-1褪黑素处理狗牙根，可以提高其耐低温胁迫能力[17-19]。LIU等[13]研究发现，利用100μmol·L-1褪黑素预处理显著缓解了干旱胁迫对番茄幼苗光合作用的不利影响。虽然褪黑素在提高植物抗逆性相关领域已有较多的研究，但梳理前人的成果不难发现，这些成果基本上集中在农业相关领域，涉及果品、种子、作物本身等。而褪黑素应用于林业生产当中的例子，目前还没有见到相关报道。本研究当中，利用100μmol·L-1的外源褪黑素对樟子松苗木进行叶面喷施，可以有效促进樟子松苗木的生长，尤其在干旱胁迫下，外源褪黑素更能促进苗木的径向生长，进而增加苗木的干物质积累量，提高苗木的生长势。本研究结果与LIU等[13]在农作物上的研究结果相一致。

光合作用是植物维持生命活动的基本的生理功能之一，叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，位于类囊体膜上。褪黑素在植物体内具有多种生理功能，它可保护叶绿素、调节植物光周期及促进植物生长等。本研究结果表明，干旱胁迫处理降低了樟子松针叶的叶绿素含量及光合速率，外源喷施褪黑素可显著提高干旱胁迫下樟子松叶绿素含量（尤其是叶绿素b），增强针叶的光合速率，这是由于针叶喷施外源褪黑素，不仅可以显著降低干旱胁迫下苗木叶片叶绿素的降解，还可以缓解气孔的关闭，改善叶片水分状况，从而提高植物叶片光合效率[19]。

CAT、POD、SOD、PPO、APX均是植物体内主要的抗氧化胁迫的酶系，通过它们的变化程度可以反映植物的抗逆性[20]。这一系列的酶系统通过相互协调、相互配合，构成了植物抵御外界胁迫的防御系统，其活性的变化，可以祛除苗木因受环境胁迫所产生的活性氧（ROS），防止苗木因ROS过量而引起细胞损伤。本研究当中，各抗氧化酶在干旱和正常水分条件下，经外源褪黑素诱导，所产生的变化规律和效果各有差异。而POD并非是诱导酶，即正常水分条件下，无论是否施用外源褪黑素，其活性均高于干旱胁迫处理组。原因可能是，POD的活性与植物的生长状况密切相关，一旦植物的生长状况受到抑制，其活性也会受到很大程度的影响。但施用褪黑素可以有效缓解这种不利，在干旱胁迫下，施用褪黑素依然可以有效提高POD活性，但不能彻底扭转苗木因受干旱胁迫所造成的生长抑制，因此，干旱胁迫下施用褪黑素的POD活性，依然不及正常水分条件的POD活性。CAT和PPO普遍存在于植物组织中，其活性与植物的抗性有一定关系，可以高效祛除生物体内因环境胁迫产生的ROS，是生物体内过氧化物酶体中极为重要的保护酶[21]。有研究表明，CAT活性受环境胁迫而诱导产生，如干旱胁迫可以诱导植物体产生大量的ROS，进而使CAT活性大幅度升高；也有研究表明其活性不受环境影响[21]。虽然，CAT活性的变化是否是由干旱引起在学界还存在一定的争议，但通过本研究的结果来看，本研究支持前者的观点，即CAT活性的变化确实与干旱胁迫的诱导密切相关。正常水分条件下，无论是否施加外源褪黑素，均不能使CAT活性有大幅升高，且无论在根、茎、叶各部分，正常水分条件下的CAT活性均没有达到显著差异水平（p＞0.05），从试验结果看，PPO具有和CAT相似的特性，即同样是一种诱导酶。

本研究中，虽然整体变化规律与CAT和POD相似，但T-SOD和Cu/Zn-SOD表现出在苗木不同部位，其活性变化出现差异的现象，即在干旱胁迫和外源褪黑素诱导下，樟子松苗木根、茎、叶各部分酶活性出现“不均衡”现象，这种“不均衡”以针叶中最为显著。也就是说，苗木针叶在受到干旱胁迫时候，T-SOD和Cu/Zn-SOD出现大幅度的升高，外源褪黑素可以使这种效应得到增强。值得一提的是，本研究仅仅采用叶面喷施的方法处理苗木，苗木的针叶自然率先接触褪黑素，如果对苗木进行“根部浇灌”的处理方式，结果是否会有不同，值得探讨。APX在本研究当中其变化规律与T-SOD和Cu/Zn-SOD相似，即针叶的诱导活性最为显著。基于此，在评价植物抗逆性的时候，不同部位的指标变化应该加以考虑。

MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，具有细胞毒性，其含量反映植物遭受逆境伤害的程度[22]。孟鹏等[23]比较研究沙地樟子松与彰武松在干旱胁迫下的生理响应，发现干旱胁迫下可以不同程度提高二者的MDA含量，表明干旱胁迫破坏了松树的细胞结构，使其细胞膜脂化加重，引起MDA含量的升高。本研究与孟鹏研究结果一致，干旱胁迫下，樟子松苗木MDA含量大幅度升高，但施加外源褪黑素可以有效缓解这种胁迫对苗木所造成的伤害，且在根、茎、叶各部分当中这种变化均达到显著差异水平（p＜0.05）。但通过本研究也发现，干旱胁迫下，施加外源褪黑素的MDA含量依然显著高于正常水分条件，表明褪黑素只能“缓解”这种胁迫，并不能彻底扭转。

本研究中，可溶性蛋白的变化规律比较“特殊”，这种“特殊”表现在，无论正常水分还是干旱胁迫下，施加外源褪黑素均能使樟子松苗木根、茎、叶的可溶性蛋白含量升高，但升高的幅度有限，没有达到显著差异水平（p＞0.05），但还是在一定程度上提高了苗木的细胞渗透性，具体原因值得进一步研究和探讨。

本研究在外源褪黑素施用下，研究樟子松苗木生长和生理指标的变化规律，可以基本肯定，外源褪黑素可以有效促进樟子松苗木的生长，提高其光合作用效率，提高其抗氧化酶系统的氧化祛除能力，进而提高其抗逆性，提高苗木的生长势。

综上所述，外源褪黑素对干旱胁迫下樟子松的生长和生理产生影响，在樟子松苗期，施加一定浓度的外源褪黑素可以有效诱导其提高抗旱性。该结果可以为今后辽西北干旱-半干旱地区苗圃高质量育苗、逆境造林与改善生态环境提供理论依据。