华南地区8种桉树基因型对Calonectria pentaseptata的抗病性研究

汪全超，陈帅飞

华南地区8种桉树基因型对的抗病性研究

汪全超，陈帅飞＊

(国家林业和草原局桉树研究开发中心，广东 湛江 524022)

由丽赤壳属真菌引起的桉树叶焦枯病是我国桉树最具威胁的病害之一。本研究利用孢子悬浮液喷雾接种法将两株菌株接种至华南地区广泛种植的8种桉树基因型，包括7种尾巨桉基因型CEPT1848、CEPT1849、CEPT1850、CEPT1851、CEPT1852、CEPT1853和CEPT1855，以及1种尾赤桉基因型CEPT1854。通过比较焦枯叶片百分比评估各桉树基因型的抗病性。结果表明7种尾巨桉基因型的抗病性存在显著差异，基因型CEPT1851的抗病性最强，基因型CEPT1849、CEPT1850和CEPT1855的抗病性相对弱；尾赤桉基因型CEPT1854的抗病性介于7个尾巨桉基因型之间。方差分析表明，菌株和桉树基因型之间存在交互效应。本研究结果拟为桉树抗病选育过程中病原菌菌株和桉树基因型的选择提供一定的指导。

桉树叶焦枯病；致病力；抗病性；病害防控

由丽赤壳属()真菌引起的人工林桉树叶焦枯病和苗圃桉树苗茎腐病对我国桉树的健康生长带来一定危害[1-5]。1985年，由丽赤壳属真菌引起的桉树苗病害在海南被发现[6]；1991年，由丽赤壳属真菌导致的桉树叶焦枯病在广西被报道[7]；随后，桉树叶焦枯病在福建、广东和云南等地相继被报道[8-10]。前期研究表明，桉树叶焦枯病广泛分布于我国福建、广东、广西、海南和云南等地，是危害我国桉树人工林最严重的病害之一[2-3]。

不同桉树基因型对丽赤壳属病原菌的抗病性存在显著差异，选育抗病桉树基因型是防控桉树叶焦枯病的有效途径之一[3,8,11-14]。前期研究结果表明，是引起雷州半岛地区桉树叶焦枯病的病原菌优势物种[3]。本研究通过测试华南地区广泛种植的8种桉树基因型对的抗病性，评估了不同桉树基因型的抗病性差异，以期为桉树抗病选育过程中病原菌菌株和桉树基因型的选择提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌菌株

2017－2018年，对广东省南部雷州半岛地区的14个样点进行系统的病害调查和样品采集，包括13个桉树人工林及1个桉树苗圃。对采集的样品进行分离，并利用多基因序列系统发生分析结合形态学进行鉴定，病原菌一致被鉴定为。选择两株菌株CSF13317和CSF13636作为供试菌株。

1.2 供试桉树材料

选择华南地区广泛种植的8种不同桉树基因型的组培苗进行抗病性测试，包括7种尾巨桉(×)基因型CEPT1848、CEPT1849、CEPT1850、CEPT1851、CEPT1852、CEPT1853和CEPT1855，以及1个尾赤桉(×)基因型CEPT1854。组培苗于2019年7－10月在荫棚中培育，长至3个月约40 cm高时，进行接种试验。

1.3 培养基的配制

2% MEA固体培养基的配制：分别称取20 g琼脂粉和20 g麦芽粉，倒入大于1 L的防爆瓶，加入1 L蒸馏水，摇晃混匀后，放入高温高压灭菌锅在121°C灭菌20 min，再分装至已灭菌的培养皿中。

1.4 病原菌分生孢子悬浮液的配制

在25°C下将菌株在2% MEA固体培养基上培养7 d，待平板上长出孢子后，使用无菌针挑取直径1 cm、带有孢子的菌饼在新的MEA培养基表面均匀涂布。于25℃下继续培养5 ~ 6 d，待培养基表面产生大量无性孢子后，加入适量无菌水，用无菌软刷轻刷培养基表面，收集孢子悬浮液；将搜集的孢子悬浮液原液倒入已灭菌的烧杯中，利用血球计数板对孢子悬浮液原液浓度进行测量，并用无菌水稀释调节浓度至1 × 104个·mL-1。测量8次，取平均值。

1.5 致病力测试

本研究采用孢子悬浮液喷雾接种法进行致病力测试。接种前24 h将桉树苗放入塑料小温室中，使温室内温度和湿度分别保持在26 ~ 28℃和70% ~ 80%。接种时将孢子悬浮液喷洒至桉树苗叶片正面和背面，使叶面达到沾满水珠状态，每株菌株分别接种至每个桉树基因型的8株苗。每个桉树基因型的8株苗喷洒无菌水，作为对照。接种72 h后进行致病力统计。整个试验在相同条件下重复一次。

接种72 h后，打开塑料温室，统计每株接种桉树苗总叶片数和焦枯叶片数，通过计算每株桉树苗焦枯叶片数占总叶片数的百分比来评价接种菌株的致病力大小和各桉树基因型的抗病性差异。

1.6 病原菌接种后再分离

为验证病害症状是否由接种的菌株引起，采用组织分离法对接种桉树苗的叶片进行病原菌再分离。用已灭菌的手术刀切取感病叶片病健交界处，大小约0.04 cm2，将其放至2% MEA固体培养基中，室温下培养4 ~ 5 d后，观察有无菌落产生，并根据菌落形态和产生分生孢子的形态来确定产生的菌落是否由接种的菌株产生。每株菌株接种的每种桉树基因型再分离4张叶片。对喷洒无菌水的桉树苗，观察叶片上是否有病斑产生，并用无菌手术刀切取叶片，大小约0.04 cm2，转接至2% MEA固体培养基，根据菌落产生的有无和形态，判断喷洒无菌水与接种菌株桉树叶片的差异。

1.7 数据分析

对焦枯叶片百分比数据进行平方根反正弦转换，得正态分布数据后，采用EXCEL整理原始试验数据，使用SPSS Statistics 22软件(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)进行方差分析。具体分析包括：(1) 针对试验、菌株和桉树基因型三个因素，以焦枯叶片面积百分比为变量，对两次试验之间的差异进行三因素单变量方差分析；(2) 针对菌株和桉树基因型两个因素，以焦枯叶片百分比为变量，对两株菌株在8种桉树基因型上的致病力差异进行双因素单变量方差分析；(3) 桉树基因型因素以焦枯叶片百分比为变量，对8个桉树基因型间的抗病性差异进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 感病症状

接种72 h后，两株菌株在8种桉树基因型上均产生病害症状，桉树苗叶片出现大量灰褐色病斑，其周围呈水渍状(图1A，B)，随后病斑不断扩大相连，引起叶片焦枯(图1C)；部分桉树苗顶梢和茎干腐烂(图1D–G)，在感病部位表面产生大量的属真菌分生孢子团(图1D，G)。接种无菌水的桉树苗上未发现感病症状。接种结果显示，两株菌株在同一桉树基因型上引起的病害程度具有一定差异(图2A，B)，同一株在不同桉树基因型上引起的病害程度也具有一定差异(图2D–G)。

另外，8种桉树基因型在接种后产生病害症状的部位具有一定差异，除桉树基因型CEPT1854的感病部位主要为叶片中下部，其余7种桉树基因型的整株苗的叶片均出现感病症状。

图1 桉树苗接种Calonectria pentaseptata菌株后产生的典型病害症状

注：A–C为桉树叶片上产生的灰褐色病斑和叶片焦枯症状；D–E为桉树苗顶梢感病后腐烂并产生大量的属真菌分生孢子团；F–G为感病茎干变黑腐烂并产生大量的属真菌分生孢子团。

2.2 病原菌接种后再分离

再分离结果显示，在感病桉树叶片病健交界处分离的菌株与最初接种菌株菌落形态一致，而在喷洒无菌水的桉树苗上未分离出丽赤壳属真菌。

2.3 两次试验差异分析

由表1可知，试验(2次)、菌株(2株)和桉树基因型(8个)因素内差异显著(均小于0.001)。因素之间的方差分析结果显示，菌株×试验差异不显著(=0.121)，其余菌株(=5.64 × 10–33)，桉树基因型(=1.94 × 10–23)，试验(=2.49 × 10–4)，菌株×桉树基因型(=3.93 × 10–7)，桉树基因型×试验(=3.23 × 10–8)，菌株×桉树基因型×试验差异都显著(=0.012)。由于两次试验之间存在显著性差异，对两次试验结果分别分析。

表1 试验、菌株和桉树基因型三因素单变量方差分析结果

图2 不同桉树基因型接种不同Calonectria pentaseptata菌株后产生的病害症状对比

注：A–C为桉树基因型CEPT1849接种菌株CSF13317孢子悬浮液（A）、菌株CSF13636孢子悬浮液（B）和喷洒无菌水（C）后的症状；D–G为桉树基因型CEPT1849（D）、CEPT1850（E）、CEPT1851（F）和CEPT1854（G）接种菌株CSF13317孢子悬浮液后症状。

2.4 菌株在桉树基因型上致病力差异分析

由图3可知，菌株CSF13317在8个桉树基因型上的致病力均大于菌株CSF13636；其中菌株CSF13317对桉树基因型CEPT1848、CEPT1849、CEPT1850、CEPT1854和CEPT1855的致病力显著大于菌株CSF13636(0.001)；菌株CSF13317和CSF13636在桉树基因型CEPT1851、CEPT1852和CEPT1853上的致病力差异不显著(=0.05 ~ 0.3)。菌株与桉树基因型之间存在交互效应(=2.27 × 10–6)，例如菌株CSF13317和CSF13636对桉树基因型CEPT1851的致病力差异不显著(=0.272)，菌株CSF13317对桉树基因型CEPT1848的致病力显著大于菌株CSF13636(<0.001)。

图3 第1次试验两株Calonectria pentaseptata(CSF13317和CSF13636)对8个桉树基因型的致病力差异结果柱状图

注：所有数据都已进行平方根反正弦转换，“Control”的结果为0，竖线表示标准误，柱状图顶部不同字母代表不同处理间差异显著(=0.05)，下同。

由图4可知，菌株CSF13317对8个桉树基因型的致病力均强于CSF13636；其中菌株CSF13317对桉树基因型CEPT1849、CEPT1850、CEPT1852、CEPT1853和CEPT1855的致病力显著大于菌株CSF13636(0.001 ~ 0.025)；两株菌对CEPT1848、CEPT1851和CEPT1854的致病力差异不显著(=0.05 ~ 0.45)。菌株与桉树基因型之间存在交互效应(=0.006)，例如菌株CSF13317和CSF13636对桉树基因型CEPT1851的致病力差异不显著(=0.056)，菌株CSF13317对桉树基因型CEPT1849的致病力显著大于菌株CSF13636(<0.001)。

两次试验结果表明，菌株CSF13317对8个桉树基因型的致病力均强于CSF13636；且菌株CSF13317对桉树基因型CEPT1849、CEPT1850和CEPT1855的致病力显著强于菌株CSF13636，两株菌对CEPT1851的致病力差异不显著。

2.5 桉树基因型抗病性差异分析

图5的结果显示，桉树基因型CEPT1851抗病性最强，显著强于除CEPT1852的其他桉树基因型(<0.05)；CEPT1852、CEPT1853和CEPT1854的抗病性较强，显著强于除CEPT1851的其他桉树基因型(<0.05)；CEPT1855的抗病性最弱，显著弱于除CEPT1848的其他6个桉树基因型(<0.05)。8个桉树基因型的抗病性从强到弱的顺序为CEPT1851>CEPT1852>CEPT1854>CEPT1853>CEPT1850>CEPT1849>CEPT1848>CEPT1855。

由图6可知，桉树基因型CEPT1851的抗病性最强(<0.05)，显著强于除CEPT1853和CEPT1854的其他5个桉树基因型；CEPT1853和CEPT1854的抗病性较强，显著强于CEPT1850(<0.05)；CEPT1850的抗病性最弱，显著弱于CEPT1851、CEPT1853和CEPT1854(<0.05)。8个桉树基因型的抗病性强弱顺序为CEPT1851>CEPT1853>CEPT1854>CEPT1848>CEPT1852>CEPT1849>CEPT1855>CEPT1850。

两次试验结果一致显示，桉树基因型CEPT1851的抗病性最强；其次是CEPT1852、CEPT1853和CEPT1854；CEPT1849、CEPT1850和CEPT1855的抗病性较弱。

图4 第2次试验两株Calonectria pentaseptata（CSF13317和CSF13636）对8个桉树基因型的致病力差异结果柱状图

图5 第1次试验8个桉树基因型对两株Calonectria pentaseptata抗病性差异结果柱状图

图6 第2次试验8个桉树基因型对两株Calonectria pentaseptata抗病性差异结果柱状图

3 结论与讨论

本研究通过将两株菌株接种至8种华南地区广泛种植的桉树基因型上进行致病力试验，结果显示接种3 d后，供测桉树基因型上出现叶片焦枯、茎干腐烂等症状，该结果与野外观察到的桉树叶焦枯病感病症状相似。致病力测试结果表明病原菌不同菌株对同一桉树基因型的致病力差异显著，不同桉树基因型对菌株的抗病性存在显著差异。

方差分析结果显示两次试验存在显著差异，这可能与两次试验的时间不同有关，导致试验过程的温度、湿度并不完全一致，且两次试验桉树苗的生长状况也存在差异。方差分析结果显示菌株×桉树基因型差异显著，表明病原菌菌株与桉树基因型在致病性/抗病性上存在交互效应。

本研究结果表明，的致病力存在较大的种内差异。测试的两株菌株在部分桉树基因型上的致病力差异显著，这与FREITAS等[15]的研究结果相似，FREITAS等用7株菌株接种至同一种巨尾桉(×)基因型，结果显示不同菌株间的致病力存在显著差异。

本研究采用孢子悬浮液接种法进行病原菌致病力测试和桉树抗病性测试。目前，丽赤壳属真菌的致病力接种方法主要是通过喷洒孢子悬浮液进行接种，此方法产生病害的症状与野外桉树感病的症状相似[3,13,15-16]。研究发现，许多菌株在多种诱导产孢的条件下均未能产生大量孢子[17]。此外，孢子悬浮液接种后对病害程度进行统计评估也比较复杂，菌饼接种法是一种高效的接种方法[18-19]，但孢子悬浮液接种法和菌饼接种法的关联研究尚未见报道，后续需要针对两种接种方法结果是否存在关联进行研究。

首次在越南的桉树和澳洲坚果上被发现[20]。随后，在中国的广东、广西和海南等地的桉树人工林感病植株以及林下土壤中被发现[8,21]。2017－2018年，WANG等[3]对雷州半岛地区的桉树人工林和桉树苗圃进行病害调查，发现桉树叶焦枯病在雷州半岛多种桉树基因型上大范围暴发，其病原菌被鉴定为。

由丽赤壳属真菌引起的桉树叶焦枯病给我国桉树带来持续不断的危害[2-3,8,22-23]，而选育抗病桉树基因型是防控桉树叶焦枯病的重要途径之一[8,11-13]。本研究结果为筛选抗病桉树基因型实践过程中病原菌菌株的选择、桉树基因型的选择以及试验设计提供借鉴和指导。

本研究结果显示，不同桉树基因型之间的抗病性存在显著差异。本研究使用的8种供测桉树基因型，其中7种属于尾巨桉，1种属于尾赤桉，致病力结果表明7个尾巨桉不同基因型之间的抗病性存在显著差异，尾赤桉基因型的抗病性介于7个尾巨桉基因型之间。国内外的其他研究结果均表明桉树不同基因型之间的抗病性存在差异[12-14]。CHEN等[14]利用从福建分离到的4种丽赤壳属真菌对G9和DH32-29两种桉树基因型进行致病力测试，结果表明两种桉树基因型对丽赤壳属真菌的抗病性存在显著差异。RODAS等[12]对巨桉()的42个基因型的进行抗病性试验发现，不同巨桉基因型间的抗病性存在显著差异。2016年，ALFENAS等[13]将接种至17个桉树树种，发现不同桉树树种之间的抗病性存在很大的种内及种间差异。因此，选择抗病桉树基因型是实现桉树叶焦枯病防控的有效途径，未来需要进一步加强此类研究。

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The Resistances of EightGenotypes in Southern China to

WANG Quanchao, CHEN Shuaifei

(,,,)

leaf blight caused byis considered as one of the most important diseases of plantationspecies in China. In this paper, the resistances of eight widely plantedclonal genotypes towas tested by spraying the conidial suspension on to leaves of these genotypes. The eight genotypes include seven×genotypes (CEPT1848, CEPT1849, CEPT1850, CEPT1851, CEPT1852, CEPT1853, CEPT1854) and one×genotype (CEPT1855). The resistance of eachgenotype was evaluated by comparing the percentage of rotten/blighted leaves. The results showed that there were significant differences in the resistances among the seven genotypes of×. The genotype CEPT1851 was most tolerant while CEPT1849, CEPT1850 and CEPT1855 were less tolerant than others. In addition, the resistance of×genotype CEPT1855 was moderate. Analysis of variance (ANOVA) showed that theisolate ×genotype interaction exists. The results of this study provide guidance for the selection of pathogen strains andgenotypes to assist the process of breedingfor disease resistance.

leaf blight; pathogenicity; resistance; disease prevention and control

S763.15

A

10.13987/j.cnki.askj.2020.02.01

国家重点研发计划课题“桉树高效可持续经营技术”(2016YFD0600505)

汪全超(1994－ )，男，在读硕士研究生，主要从事森林病害研究，E-mail: wangquanchaocerc@163.com

陈帅飞(1982－ )，男，博士，研究员，主要从事森林病害研究，E-mail:cerccsf@126.com