蒙古族结核病患者CYP2E1基因多态性及其启动子区甲基化水平与抗结核药物致肝损伤的关系

胡宝翠,郝金奇,施瑞清,侯瑞丽,余艳琴,张 冬,邓乐乐,韦丽琴

0 引 言

抗结核药物致肝损伤(anti-tuberculosis drug-induced hepatic injury, ADIH)是结核病患者在进行抗结核药物治疗时的不良反应之一，其发生率在2.5%～34.9%[1-3]，不同国家和民族有所不同。抗结核药物主要是在肝中经药物代谢酶作用进行代谢，参与该代谢过程的药物代谢酶主要有Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶。与ADIH发生相关的Ⅰ相药物代谢酶主要有CYP450酶系，Ⅱ相药物代谢酶主要有NATs酶系和GSTs酶系[4-5]。有研究者发现NAT2慢乙酰化基因型是ADIH发生的危险因素[6]。除此之外，遗传因素中的表观遗传学也在ADIH的发生发展中发挥重要作用[7]。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分。有研究表明，细胞色素P450 1A1基因CpG岛甲基化与ADIH的发生相关，其调整OR值和95%CI分别为2.090和1.107～3.946 (P=0.023)[8]。动物实验表明，谷胱甘肽S转移酶P1、细胞色素P450 1A1和1B1启动子区CpG岛甲基化对异烟肼诱导的大鼠肝损伤有调控作用[9-10]。

CYP2E1基因控制表达的酶是CYP450酶系的一种重要药物代谢酶。CYP2E1酶活性受基因位点的多态性调控，其中CYP2E1 rs2031920野生型等位基因(C1)的第1053位核苷酸存在一个RsaI酶识别部位，而突变型等位基因(C2)在该处发生点突变(C→T)后，使RsaI酶识别部位消失，这2种等位基因形成C1/C1、C1/C2 和C2/C2 3种基因型，从而影响CYP2E1酶活性的表达[1]。有研究发现CYP2E1基因多态性与ADIH发生相关，但存在争议[11-12]，而且CYP2E1基因分布在人群中存在着明显的种族差异[13]。考虑到种族和基因多态性的情况，研究CYP2E1基因甲基化与ADIH发生的关系的报道甚少。本研究旨在探讨蒙古族结核病患者CYP2E1基因多态性及启动子区甲基化水平与ADIH的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2015年11月至2018年6月于内蒙古通辽市结核病防治所进行标准化治疗的135例蒙古族结核病患者。根据ADIH判定标准[14]选取发生肝损伤的蒙古族结核病患者为ADIH组(n=45)，按照1∶2比例匹配未发生肝损伤的蒙古族结核病患者为对照组(n=90)。纳入标准：①痰结核杆菌培养或胸部X线检查诊断为结核的患者；②接受异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等一线抗结核药物治疗；③抗结核治疗前肝功能检查结果正常，治疗期间有至少3次以上肝功能检查结果；④在抗结核治疗前未服用过其他影响肝功能的药物(如对乙酰氨基酚等)；⑤研究对象为蒙古族，且祖上3代均无与外族通婚史。排除标准：①患有其他肝疾病(如酒精性肝病、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等)，或者其他可能导致肝功能紊乱的全身性疾病；②合并有心、肺、脑、肾、恶性肿瘤等严重器质性疾病的患者；③严重营养不良患者、孕妇、精神疾病的患者等。本研究经过内蒙古科技大学包头医学院医学伦理委员会批准[批准号:2018(003)]，患者均签署知情同意书。

1.2 流行病学调查查阅文献、咨询专家，制定ADIH相关因素调查问卷。调查内容包括姓名、性别、出生日期、身高、体重、教育程度、婚姻状况、职业等一般情况；吸烟、饮酒等生活习惯；既往患病史、抗结核药物治疗方案及肝功检查结果等结核病相关因素。

1.3 检测指标及方法

1.3.1ADIH诊断标准根据中华医学会结核病学分会与《中华结核和呼吸杂志》编辑委员制定的《抗结核药物所致药物性肝损伤诊断与处理专家建议》，间隔2周以上、连续2次检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)或谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)高于正常值上限(40 U/L)或总胆红素高于2倍正常值上限(38 μmol/L)，或单次检测ALT或AST高于2倍正常值上限(80 U/L)[14]。

1.3.2DNA提取采集患者静脉血5 mL置于EDTA-K2抗凝管中，应用全基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)，按照说明书方法提取300 μL静脉血中的DNA，将DNA溶解于50 μL TE缓冲液中，-20 ℃储存以用于后期CYP2E1基因多态性和甲基化水平检测。

1.3.3 聚合酶链反应(PCR)扩增CYP2E1基因从 NCBI 数据库中获得CYP2E1 rs2031920基因及β球蛋白内参序列信息，利用Oligo6.0软件设计引物，β球蛋白内参上游引物5'-GTAGACCACCAGCAGCCTAAG-3'，下游引物5'-CATCTGACTCCTGAGGAGAAGT-3'；CYP2E1 rs2031920上游引物5-GCAGCACAACCAATGACTTGCTT-3′，下游引物5- AATACATGAAAGAAGAAGCTAGTCA-3′，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。CYP2E1 rs2031920基因PCR产物长度414 bp，β球蛋白内参PCR产物长度为232 bp。CYP2E1 rs2031920基因PCR扩增体系：在50 μLPCR反应体系中，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 1 μL，超纯水 20 μL，2×Taq Master Mix 25 μL。PCR扩增条件：①195 ℃预变性5 min，②295 ℃变性1 min，③355 ℃退火1 min，④472 ℃延伸1 min，②-④步骤 35个循环后72 ℃延伸10 min。

1.3.4CYP2E1rs2031920基因型确定方法首先取10 μL PCR扩增产物，加入限制性内切酶RsaI 1 μL、ddH2O 17 uL、green buffer 2 μL，37℃水浴3 h进行酶切反应。然后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，若电泳实验结果显示某样本有187 bp和227 bp 2条带，则CYP2E1 rs2031920为C1/C1基因型；若显示有187 bp、227 bp和414 bp 3条带，则CYP2E1 rs2031920为C1/C2 基因型；若只有414 bp 1条带，那么CYP2E1 rs2031920为C2/C2基因型。以此确定CYP2E1 rs2031920的基因型。

1.3.5CYP2E1基因启动子区CpG岛甲基化水平检测通过Agena MassArray®飞行质谱分析系统检测CYP2E1基因启动子区的甲基化水平，过程包括DNA质控(DNA浓度>30 ng/μL，纯度A260/A280为1.7～2.0，A260/A230>1.4)、合格DNA亚硫酸盐处理(目的是将DNA中未甲基化的C转化为U)、PCR扩增(上游引物序列为：5′-GTTTTGAGAAGGAGGGTGATTTATT，下游引物序列为3′-TCCTTCTAACCCCATTCATATAACA)、SAP 反应、DNA转录、T切/RNAse A 消化反应(将DNA转录的RNA片段切割成携带有CpG位点的小片段)、树脂纯化等。基因甲基化水平计算公式如下：

基因甲基化水平=CpG片段数/(CpG片段数+CpA片段数)

其中CpG代表甲基化的DNA，CpA代表未甲基化的DNA。

2 结 果

2.1 一般情况ADIH组与对照组在性别、年龄、婚姻状况、教育程度等方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表 1 蒙古族结核病患者一般特征比较

Table 1 Comparison of general demographic characteristics of Mongolian tuberculosis patients

因素对照组(n=90)ADIH组(n=45)χ2值P值男/女(n)62/2826/191.6320.201年龄[n(%)]1.3530.245 <40岁48(53.33)19(42.22) ≥40岁42(46.67)26(57.78)婚姻状况[n(%)]1.1110.574 未婚30(33.33)11(24.44) 已婚55(61.11)31(68.89) 离异或丧偶5(5.56)3(6.67)教育程度[n(%)]0.6930.707 小学及以下28(31.11)14(31.11) 初高中/中专46(51.11)26(57.78) 大专及以上16(17.78)5(11.11)职业[n(%)]0.6530.721 农民35(38.89)16(35.57) 牧民7(7.78)5(11.11) 其他48(53.33)24(53.33)BMI[n(%)]1.780.411 <18.5 kg/m218(20.00)4(8.89) 18.5～23.9 kg/m253(58.89)29(64.44) ≥24 kg/m219(21.11)12(26.67)吸烟史(n)26120.0730.787饮酒史(n)1490.2250.635

2.2CYP2E1 rs2031920基因型分布135例患者中纯合野生C1/C1型62例(45.93%)、杂合C1/C2型68例(50.37%)、纯合突变C2/C2 型5例(3.70%)。患者CYP2E1 rs2031920位点C1/C1、C1/C2、C2/C2的基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=3.22，P>0.05)。CYP2E1 rs2031920基因型在ADIH组和对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05)，检验效能是0.93。C1和C2基因频率在ADIH组和对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图1。

表 2CYP2E1 rs2031920基因型及基因频率的分布[n(%)]

Table 2 The distribution ofCYP2E1 rs2031920 genotype and gene frequencyn(%)

CYP2E1rs2031920对照组(n=90)ADIH组(n=45)χ2值P值基因型0.5500.760 C1/C142(46.67)20(44.44) C1/C244(48.89)24(53.33) C2/C24(4.44)1(2.22)基因频率0.0001.000 C1128(71.11)64(71.11) C252(28.89)26(28.89)

M：Maker； 1-9：9个样本的序号

图 1CYP2E1 rs2031920酶切产物琼脂糖凝胶电泳图

Figure 1 Agarose gel electrophoresis ofCYP2E1 rs2031920 enzymatic cleavage product

2.3CYP2E1基因启动子区甲基化水平与ADIH的关系对135名蒙古族结核病患者提取的DNA进行质检，仅80例患者(ADIH组27例，对照组53例)符合本研究对基因甲基化水平检测要求。2组的性别、年龄、婚姻状况、教育程度、职业、BMI等方面构成差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

CYP2E1基因启动子区PCR扩增目的片段大小为493 bp，该片段预测共包含9个CpG位点，本研究检测到全部位点。其中CYP2E1_CpG_1.2.3的甲基化水平相近，将这3个位点合并为一个位点进行分析。ADIH组和对照组在CYP2E1_CpG_1.2.3.4.5.6位点和总体甲基化水平间差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表 3 2组符合甲基化检测要求的患者一般人口学特征比较

Table 3 Comparison of general demographic characteristics of ADIH patients with methylation detection

因素对照组(n=53)ADIH组(n=27)χ2值P值男/女(n)30/2315/120.0080.929年龄[n(%)]1.3630.243 <40岁25(47.17)9(33.33) ≥40岁28(52.83)18(66.67)婚姻状况[n(%)]0.8300.660 未婚11(20.75)3(11.11) 已婚38(71.70)22(81.48) 离异或丧偶4(7.55)2(7.41)教育程度[n(%)]1.2440.537 小学及以下18(33.96)8(29.63) 初高中/中专27(50.94)17(62.96) 大专及以上8(15.09)2(7.41)职业[n(%)]0.6500.722 农民23(43.40)11(40.74) 牧民5(9.43)5(18.52) 非农牧民25(47.17)11(40.74)BMI[n(%)]1.8740.392 <18.5kg/m212(22.64)4(14.81) 18.5～23.9 kg/m231(58.49)15(55.56) >24 kg/m210(18.87)8(29.63)吸烟(n)1480.0930.761饮酒(n)940.0320.857

CYP2E1基因CpG位点对照组ADIH组Z值P值CpG_1.2.30.697±0.0260.806±0.135-3.2070.001CpG_40.723±0.0370.663±0.098-2.9630.003CpG_50.856±0.0460.666±0.244-3.3750.001CpG_60.872±0.1590.803±0.152-2.4000.016CpG_70.846±0.1370.789±0.114-1.5490.121CpG_80.441±0.2860.372±0.327-1.0570.291CpG_90.881±0.0310.877±0.024-0.6040.546CpG_1～90.759±0.0620.711±0.085-2.4680.014

2.4 ADIH相关因素的Logistic回归分析一般人口学特征和生活习惯等因素在ADIH组和对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05)，将CYP2E1 rs2031920基因C1/C1、C1/C2 、C2/C2基因型和CYP2E1基因总体甲基化水平4个变量代入条件Logistic回归分析结果显示，仅CYP2E1基因启动子区总体甲基化水平与ADIH的发生有关(P<0.005)，甲基化水平每升高0.1个单位，ADIH的发生风险降至0.388倍，OR值(95%CI)是0.388(0.204～0.739)。见表5。

表 5 ADIH相关影响因素的条件Logistic回归分析

Table 5 Conditional logistic regression analysis of ADIH related factors

相关因素βSEWaldχ2P值OR(95%CI)CYP2E1rs2031920C1/C1型-0.8051.4760.2980.5850.447(0.025～8.057)CYP2E1rs2031920C1/C2型-0.8611.4540.3500.5540.423(0.024～7.315)CYP2E1rs2031920C2/C2型0.8051.4760.2980.585 2.238(0.124～40.340)CYP2E1基因启动子区总体甲基化水平-0.9460.3298.2880.0040.388(0.204～0.739)

3 讨 论

CYP2E1酶参与异烟肼和利福平的氧化代谢过程，其酶活性的改变可影响肝的代谢过程[15-16]。本研究中，蒙古族结核病患者CYP2E1 rs2031920基因位点的基因型以杂合子C1/C2型为主，占50.37%，CYP2E1 rs2031920基因多态性在ADIH组和对照组之间分布未见差异，条件logistics回归也未发现CYP2E1 rs2031920基因多态性与ADIH发生相关，本研究的把握度达到了93%。这与Tang等[17]和Xiang等[18]研究结果一致。但也有相关报道称CYP2E1 C1/C1基因型患者更易患肝损伤[19]。向阳等[20]分析显示，携带CYP2E1 C1/C1基因型的成人结核病患者发生肝损害的危险性会增加；国外的一篇meta分析结果显示CYP2E1 C1/C1基因型显著增加了ADIH的患病风险[21]。出现这种结果的原因可能是：①被调查人群种族不同，本研究纳入人群均为三代以内无外族通婚史的蒙古族结核病患者，在ADIH组和对照组间未发现一般人口学特征等因素存在差异，很好的纯化了研究对象，本研究与Tang等[17]和Xiang等[18]的研究对象虽民族不同，但均属亚洲人种，因此结果一致，而向阳[20]和国外的meta分析[21]包括亚洲、欧洲、非洲和美洲多种人种，有人种的混杂影响；②ADIH的发生受多个基因、环节及环境因素的影响，单个基因某一位点变异在整个机制中可能只起部分作用，本研究结果显示CYP2E1基因rs2031920这一位点对ADIH发生的影响。

有研究表明，BMI、酒精、性别、年龄、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒或HIV感染等因素，都与ADIH的发生有关[22]。基因启动子区CpG岛的甲基化可能通过影响转录因子与DNA结合位点的结合，或通过改变染色质构象进行间接转录调控，从而影响基因的表达，进一步影响疾病的进展[23-26]。为了更好地探讨CYP2E1基因启动子区甲基化水平与ADIH发生之间的关系，本研究将ADIH组和对照组中的性别、年龄、婚姻状况、教育程度、职业、BMI、吸烟和饮酒因素进行了匹配，进一步证明这些因素在2组中分布均衡。本研究通过定量的方法对80例(ADIH组27例，对照组53例)蒙古族结核病患者的CYP2E1基因启动子区甲基化水平进行了检测，调整CYP2E1 rs2031920 基因多态性对ADIH的影响，CYP2E1基因启动子区甲基化水平高低仍与ADIH的发生有关，随着甲基化水平的升高，ADIH发生的危险性逐渐降低，说明CYP2E1基因启动子区甲基化水平是蒙古族ADIH发生的保护因素。这与邓乐乐等[27]对蒙古族结核病患者的研究结果相一致。这与Zhang等[28]对汉族结核病患者的研究认为CYP2E1基因启动子区甲基化是ADIH发生的危险因素相悖。有关CYP2E1基因启动子区甲基化水平与结核病患者患ADIH的关系存在争议，原因可能是：①基因甲基化水平检测方法不同，本研究使用MassArrAy 系统检测基因甲基化水平，检测的基因长度为493bp，精确检测该片段的9个CpG位点的甲基化水平，是定量检测；其他研究多是采用EZ DNA甲基化试剂盒和甲基化特异性 PCR技术，检测的基因长度为200bp～300bp，对基因是处于甲基化状态或非甲基化状态进行定性研究。②混杂因素的控制，此次的病例对照研究，各影响因素在ADIH组和对照组中分布均衡。另外，目前有关药物代谢酶基因甲基化水平与ADIH发生相关性的人群研究极少，且结果间存在较大差异，尚没有系统综述或meta分析描述两者之间的关系，这需要我们进一步研究证实，为ADIH的发生发展寻求更多依据。

综上所述，本研究发现蒙古族结核病患者ADIH的发生与CYP2E1 rs2031920基因多态性不相关，但与CYP2E1基因启动子区甲基化水平的高低存在相关性，这一发现为深入研究ADIH的发生机制提供了新的思路和证据。