外泌体相关RNA结合蛋白基因通过参与先天免疫对肝细胞癌发展的可能性影响研究

黄小程，黄双平，董梦婷，陈 淼，阚 宠，卢东军，唐玉莲，倪安妮，李根亮

(右江民族医学院,广西 百色 533000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因。多种RNA结合蛋白表达异常或功能异常与肿瘤的发生发展密切相关[1-2]。RNA结合蛋白是一类能够决定细胞分化、活动力和生长等过程的调节因子，可参与RNA的剪接、多聚腺苷化、序列的编辑、RNA 转运、维持 RNA 的稳定及参与其降解、细胞内定位和翻译调节等[3]，可通过多种方式影响肿瘤的发生发展[4-5]。外泌体内含有多种功能分子，广泛参与各种生理和病理过程，包括肿瘤的发生发展过程[6]。RNA结合蛋白也可能存在于外泌体中，但其是否参与肿瘤的发生发展过程还有待深入研究。肿瘤的发生发展必然伴随着机体对病变细胞的免疫清除，尤其先天免疫过程[7-8]。但外泌体相关RNA结合蛋白是否参与肿瘤发生发展过程中的先天免疫及如何参与也尚不清楚。

因此，本研究通过建立肝癌小鼠模型，分离癌变后的瘤体组织及健康肝组织,通过RNA-seq和生物信息学手段分析HCC瘤体组织中外泌体相关RNA结合蛋白相关基因的表达情况，分析其是否参与以及如何参与HCC发生发展过程中的先天免疫过程。研究结果可能为深入理解HCC的发生发展机制及诊断治疗HCC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1肝癌小鼠模型的构建及样本获取:选取120只鼠龄7周左右，体重22～25 g的清洁健康昆明小鼠。将其随机分为两组，实验组和对照组各60只。购自南京凯基生物技术有限公司的H22肝癌细胞系，体外培养至细胞指数生长期时，取细胞3 000 r/min离心、洗涤、稀释至终浓度105个/ml，给予实验组小鼠双前肢腋下接种细胞悬液0.2 ml/只，对照组采用生理盐水同法注射，正常饲养4周后，选出成瘤小鼠(n=50)，解剖取出瘤体作为肿瘤微环境(TM)样本，对照组健康小鼠肝脏作生理微环境(PM)样本(n=60)。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2RNA提取及RNA-seq:实验组和对照组组织样本，采用RNA提取试剂盒提取各样本总RNA，同组内等量取各样本总RNA混合成混合总RNA样本送公司测序。RNA质量检测、逆转录、文库构建、RNA-seq及去掉低质量的序列后得到待分析数据(clean reads)按常规程序完成。

1.3筛选出在两类样本中差异表达的RNA结合蛋白基因:以各基因匹配的clean reads数为依据，统计分析各基因RPKF值的差异，以实验组和对照组同一基因之间的RPKF值比值≥2或≤0.5，且FDR值≤0.05的基因为条件，获得两样本的差异表达基因。

使用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以“(cancer or carcinoma) and ‘RNA binding protein’”为关键词检索RNA结合蛋白基因，构建基因比对数据库。通过DAVID在线数据库(https://david.ncifcrf.gov)转换成Ensembl gene ID后与两样本测序数据中的差异表达基因进行比对，筛选出两类样本中差异表达的RNA结合蛋白基因。

1.4参与先天免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白基因的获取及功能分析:利用DAVID数据库对以上差异表达的RNA结合蛋白基因进行在线功能富集与聚类，筛选其中参与先天免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白基因，再次使用DAVID筛选到的基因进行GO和KEGG分析，其中以FDR(false discovery rate)≤0.05且P<0.05为差异有统计学意义。

1.5参与先天免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白基因的SNV和INDEL分析:根据RNA-seq数据对外泌体相关RNA结合蛋白基因进行单核苷酸位点变异(single nucleotide variants, SNV)及核苷酸插入/删除(INDEL)分析，探讨其与基因表达的可能相关性。

1.6参与先天免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白基因编码蛋白的互作分析:采用STING数据库(https://string-db.org/)对参与先天免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白基因的编码蛋白进行互作分析。

1.7差异表达基因的RT-qPCR验证:随机选择3个参与先天免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白基因进行 RT-qPCR 分析，内参基因为 RN18s，验证其表达量以及RNA-seq测序结果准确性。

2 结果

通过筛选共获得了69个参与先天免疫反应的差异表达的外泌体相关RNA结合蛋白基因。DAVID数据库功能富集分析结果显示，它们共参与了12个BP、4个CC、1个KEGG和3个UP-SEQ(见图1)。GO分析发现，这些差异表达基因主要聚集在免疫应答，尤其是先天免疫，还有参与补体激活经典途径、炎性反应等。其中大量基因存在N-连接糖基化位点、二硫键及信号肽。这些差异表达基因的编码蛋白互作情况见图2。

SNV和INDEL分析显示，有55个差异表达基因发生了520 个SNV 和22个INDEL 位点的改变，具有统计学意义的有15个基因，它们分别是Apobec3、Myo1g、App、Src、Pstpip1、Aim2、Cd5l、Il1rap、C4bp、Apcs、Hc、Tec、Fgg、Ifit1和Cfi，且SNV 改变与其基因的表达呈负相关。

注：BP，生物学程序；CC，细胞组分；MF，分子功能；UP-SEQ，蛋白位点序列特征图1 TM中瘤体组织外泌体相关差异表达基因的生物学功能

图2 HCC中参与免疫应答的RNA结合蛋白基因编码蛋白的互作

随机选择的3个差异表达基因RT-qPCR 分析，其结果与 RNA-seq 结果一致(见图3)。3个差异表达基因和18sRNA内参基因的引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

基因引物5'-引物3'-引物18sRNAGGTGAAGGTCGGTGTGAACGCTCGCTCCTGGAAGATGGTGFasGCCAACCTGAAAACTAGGCTGCGTTTGGCTTCTTTACCCACCCtnna1AAGTCTGGAGATTAGGACTCTGGACGGCCTCTCTTTTTATTAGACGTnfrsf1bACACCCTACAAACCGGAACCAGCCTTCCTGTCATAGTATTCCT

注：图中数值为以2为底的对数值图3 RT-qPCR 与 RNA-seq 分析HCC中参与先天免疫反应的外泌体相关RNA结合蛋白基因的表达情况

3 讨论

基因表达的转录后修饰是重要的表观调控机制，转录后修饰包括RNA剪接、编辑、稳定性、定位、修饰、翻译及3′多聚腺苷酸化和5′加帽等[9]。RNA结合蛋白是转录后修饰的重要参与者，有多种RNA结合蛋白参与肿瘤的发生发展过程[10-11]。

本研究也显示，与健康肝组织相比，HCC 中共有69个差异表达的外泌体相关RNA结合蛋白基因可能参与先天免疫反应，说明这些基因在参与HCC的发生发展中对早期清除癌细胞及其引起的相关炎性可能起着重要作用。在这些差异表达的基因里不同的基因在HCC发生发展的过程中可能参与不同的反应，进而对肿瘤的发生发展有着不一样的影响。如Han等发现，RNA结合蛋白SORBS2基因通过稳定RORA基因来抑制HCC的发生和转移[10]。Dong等则发现，RNA结合蛋白RBM3基因通过调节环状核糖核酸SCD-circRNA 2的产生促进HCC的细胞增殖[11]。

另外本研究还发现外泌体相关RNA结合蛋白可能还参与炎性反应。已有研究报道HCC的入侵常会引起机体的炎性反应，而持续存在的炎性可能促进癌症的发生、发展。Yiakouvaki等研究表明，RNA结合蛋白Hur基因结合并调节先天免疫应答的有效激活，并与依赖于编码炎性效应蛋白的mRNAs的产生和转录后调节相关，进而导致结肠炎相关癌症的严重易感性增高[12]。本研究发现外泌体相关RNA结合蛋白基因还涉及后天性免疫反应，所以它们对HCC中癌细胞及相关炎性的清除可能是持续性的，即在后续的特异性免疫反应中也可能发挥着一定的作用。但由于后天性免疫涉及的基因较少，而先天性免疫反应涉及的基因相对较多，因此外泌体相关RNA结合蛋白基因在HCC发生发展中的作用可能更倾向于非特异性的防御保护。

通过对这些基因的功能富集分析，发现多种外泌体相关RNA结合蛋白存在N-连接(N乙酰葡萄糖胺)糖基化位点、二硫键及信号肽序列，说明这些差异表达基因编码蛋白可能是通过糖蛋白的N-粘连方式或二硫键方式与受体结合而参与先天性免疫反应。信号肽的存在说明多种基因编码蛋白为膜蛋白，这与多种外泌体相关RNA结合蛋白的胞外分布特点是相一致的，这也说明外泌体相关RNA结合蛋白的功能可能涉及从胞外到胞内的信号转导。二硫键是多肽链内部或多肽链之间的一种共价结合方式，表明相关分子之间连接的紧密性，这与其他研究发现相一致，即二硫键与癌症病变及其迁移密切相关[13-14]。N-粘连糖蛋白是血液、尿液和唾液等体液中最常见的一种细胞分泌蛋白，其寡糖链分支增多及复杂化与HCC的发生发展密切相关[15-17]。马瑾等发现，HP、hCE1蛋白表达变化和N-糖链变异可能参与了HCC发生发展过程[18]。所以推测外泌体相关RNA结合蛋白可能通过糖蛋白N-粘连的方式与肿瘤坏死因子受体的结合参与HCC中的先天性免疫反应，从而影响HCC的发生发展。对外泌体相关RNA结合蛋白基因的SNV和INDEL分析还显示，HCC中SNV改变与其基因的表达呈正相关，这说明SNV可能对基因表达具有正调控作用。

综上所述，本研究利用RNA-seq及生物信息学手段，发现在TM和PM中外泌体相关RNA结合蛋白基因存在差异表达，生物信息学显示其可能涉及到多个生物学过程，且可能通过参与先天免疫影响HCC发展。推测外泌体相关RNA结合蛋白基因可能通过糖蛋白N-粘连或二硫键的方式与受体结合参与HCC中的先天性免疫反应，以非特异性的防御保护影响肿瘤的发生发展，但未能对可能的机制机理进行论证和深入探讨，是本研究的不足之处。今后将继续对外泌体相关RNA结合蛋白基因可能通过先天免疫参与HCC发生发展的机制进行深入实验研究，以期为更好理解HCC发生发展机制及诊断预防提供理论依据。