延胡索丁素对大鼠心肌梗死的保护作用及机制研究

林岳 姜盈盈 吕望 金焕治 陈玲珑

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）作为心血管急重症，在临床较为常见。因其冠状动脉阻塞持续影响心肌供血，最终诱导心肌坏死［1］。AMI具有发病急促、病情严重、病死率高等特点，可导致恶性心律失常、室间隔穿孔、心脏破裂或猝死等症状［2］。中医药对于心肌梗死的临床治疗具有悠久历史，可通过多靶点、多途径改善AMI后心肌损伤，增强心功能及缓解患者症状。中药延胡索为罂粟科（Papaveraceae）紫堇属（Corydalis）植物延胡索（Corydalis yanhusuo W. T. Wang）的干燥块茎，始载于《神农本草经》，具有活血散瘀、理气止痛等功效，常用于胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛等治疗［3］。研究发现延胡索具有良好的镇痛、抗心律失常及改善冠心病等作用［4］。关于延胡索的化学成分研究始于上世纪20年代，延胡索丁素（Tetrahydrocoptisine，THC）作为其重要组成成分，具有良好的抗炎作用［5］。然而延胡索中THC对于AMI是否同样具有良好的作用尚不清晰，因此本课题拟建立AMI大鼠模型，通过现代生物医学技术深入考察延胡索丁素改善AMI的作用及机制，为延胡索的临床应用奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄SD健康雄性大鼠50只，体重平均（220±20）g，清洁级，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011），购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠饲养于层流架中，12h昼夜交替，自由进食饮水，保持恒温。适应性喂养1周后开展相关实验。

1.2 主要试剂及仪器 延胡索丁素（HPLC≥98%，HT033199），宝鸡市辰光生物科技有限公司；阿司匹林（HPLC≥98%，37655），美国 Aladdin公司；cTnI、CK-MB、Myo相关ELISA试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），南京建成生物工程研究所；蛋白提取试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；NLPR3、ASC及Caspase-1抗体，美国CST公司；ECL显影试剂盒，美国GE公司；SDS-PAGE试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。小动物呼吸机，上海奥尔科特生物科技有限公司；高分辨小动物超声影像系统，加拿大Visual sonics Inc公司；垂直电泳仪、半干转膜仪，美国Bio-Rad公司；凝胶图像分析系统，美国GE公司；MK3型酶标仪，美国Thermo公司。

1.3 模型建立 选择40只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg）进行麻醉，将其固定于手术台并气管插管进行机械通气。消毒手术区域，打开胸腔暴露心脏，在左心耳及右心室流出道间对冠脉左前降支（LAD）进行结扎。当结扎线以下心肌组织泛白发绀，同时心电图检查有≥2个导联J点抬高＞0.2mm时，表明模型建立成功。将心脏送回胸腔，挤压排除空气，缝合胸骨、肌层与皮肤。

1.4 分组与给药 将模型大鼠随机分为模型组、THC低剂量组（10mg/kg）、THC高剂量组（30mg/kg）、阳性对照组（阿司匹林，30mg/kg）。另取10只已进行手术但并未结扎的健康大鼠作为假手术组。各给药组灌胃相应药物28d，假手术组给予等量生理盐水。

1.5 超声心动图检测 给药结束，大鼠腹腔麻醉后备皮并固定于手术台，用小动物超声仪在17.5MHz对其检测。主要检测内容包括：左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室舒张末期容积（LVEDV）及左心室射血分数（LVEF），取其中连续6个心动周期的平均值。

1.6 ELISA法检测 大鼠采用眼眶采血，静置30min后低温离心（3500 r/min）5min，分离上层血清并与-20℃保存。根据试剂盒说明书检测血清中肌钙蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）与肌红蛋白（Myo）含量。

1.7 形态学考察 将大鼠脱颈椎处死，取其心脏。将部分心脏进行切片（2mm），置入-20℃冷冻后，在20%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中避光孵育15min。随后进行形态学考察，心脏梗死部位为灰白色，正常组织为红色。采用Image J软件计算梗死面积比例=梗死面积/（梗死面积+非梗死面积）×100%。随后，从10%甲醛溶液中取出心脏组织，经石蜡包埋、切片、脱蜡、脱二甲苯、核染、分化与漂洗、染色、脱水、透明和封片，在光镜下对心脏组织进行考察。

1.8 Western bloting检测 取心脏组织溶于裂解缓冲液中，根据BCA试剂盒说明书对蛋白浓度进行测定。经上样缓冲液孵育后，各组取等量蛋白使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移至聚偏二氟乙烯膜。经5%BSA封闭后加一抗（NLPR3、ASC及caspase-1，1∶1000）在-4℃冰箱孵育过夜。次日在常温条件下滴加二抗孵育30min，化学发光蛋白检测试剂盒显影成像。使用Image J软件对各组蛋白表达进行半定量，β-Tubulin作为内参。

1.9 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏超声结果比较 见表1。

表1 各组大鼠超声结果的比较（）

表1 各组大鼠超声结果的比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，△P＜0.01

组别 n LVEF（%） LVEDV（μl） LVESV（μl）假手术组 10 75.07±4.01 382.52±23.42 95.98±21.62模型组 10 61.49±5.0* 436.98±19.66* 167.61±14.39#THC低剂量组 10 67.46±2.76 429.28±36.67 139.96±19.29 THC高剂量组 10 71.96±3.97▲ 384.92±19.90▲ 107.40±9.99△阳性对照组 10 73.34±5.45▲ 382.21±19.96▲ 101.16±15.81△

2.2 各组大鼠心脏指数及梗死比例的比较 见表2。

表2 各组大鼠心脏指数及梗死比例的比较［%，（）］

表2 各组大鼠心脏指数及梗死比例的比较［%，（）］

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01

组别 n 心脏指数 梗死比例假手术组 10 0.29±0.05 0.0±0.0模型组 10 0.46±0.05* 35.31±3.47*黄柏碱低剂量组 10 0.44±0.04 28.2±1.24#黄柏碱高剂量组 10 0.34±0.03# 19.1±0.90▲氨苄青霉素钠组 10 0.33±0.03# 20.76±1.45▲

2.3 各组大鼠体内心肌损伤标志物含量比较 见表3。

表3 各组大鼠血清中心肌损伤标志物含量的比较［μg/L，（）］

表3 各组大鼠血清中心肌损伤标志物含量的比较［μg/L，（）］

注：与假手术组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，△P＜0.01

组别 n CK-MB cTnl Myo假手术组 10 5.3±0.97 0.13±0.02 39.46±4.24模型组 10 65.17±7.72# 9.88±0.44# 51.90±4.55*THC低剂量组 10 42.11±4.58▲ 5.66±0.45△ 44.97±3.51 THC高剂量组 10 26.09±4.09△ 4.74±0.37△ 40.53±4.61▲阳性对照组 10 23.04±2.61△ 4.71±0.37△ 41.97±3.51▲

2.4 各组大鼠心脏病理学改变的比较 HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌纤维呈粉红色、层次明显、分布均匀，无心肌纤维化，未见心肌间质炎症细胞浸润及梗死病灶等。模型组大鼠心肌组织梗死严重，病灶边缘心肌纤维排列紊乱、断裂，可见大量瘢痕及炎性细胞浸润、炎症性充血等。THC低剂量组大鼠心肌细胞排列不清，细胞边界模糊，可见部分炎性细胞浸润及局部坏死等现象。THC高剂量组与阳性对照组大鼠心肌细胞排列整齐，边界清楚，少量炎症细胞浸润，无明显坏死现象，细胞间质可见轻度水肿。见图1。

图1 各组大鼠心脏组织HE染色

2.5 各组大鼠心脏组织NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表达比较 见表4、图2。

表4 各组大鼠心脏组织NLRP3、ASC及Caspase1表达水平的变化（）

表4 各组大鼠心脏组织NLRP3、ASC及Caspase1表达水平的变化（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，△P＜0.01

组别 n NLPR3/β-Tubulin ASC/β-Tubulin Caspase1/β-Tubulin假手术组 10 1.0±0.06 1.0±0.10 1.0±0.11模型组 10 2.34±0.08* 2.55±0.25# 1.89±0.17#THC低剂量组 10 1.96±0.13▲ 1.90±0.09▲ 1.47±0.20▲THC高剂量组 10 1.91±0.21▲ 1.24±0.09△ 1.19±0.16△阳性对照组 10 1.75±0.14bb 1.51±0.24△ 1.27±0.16△

图2 各组大鼠心脏组织NLRP3、ASC及Caspase1表达水平的变化

2.6 各组大鼠血清中IL-1β及IL-18含量的比较 见表5。

表5 各组大鼠肾血清IL-1β及IL-18含量的变化［pg/ml，（）］

表5 各组大鼠肾血清IL-1β及IL-18含量的变化［pg/ml，（）］

注：与假手术组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，△P＜0.01

组别 n IL-1β IL-18假手术组 10 17.31±3.16 22.63±2.36模型组 10 55.34±6.56* 74.13±7.29#THC低剂量组 10 42.16±4.59▲ 59.21±2.60▲THC高剂量组 10 27.34±4.29△ 34.37±5.25△阳性对照组 10 30.37±2.44△ 31.58±3.57△

3 讨论

急性心肌梗死是临床常见危急重症，其发病因素主要为冠状动脉粥样硬化狭窄，吸烟、饮酒、情绪激动、过度劳累等，继而导致心力衰竭、心功能不全及心律失常。该病通常严重影响患者身心健康，大幅降低患者生活质量，是心血管疾病患者致死的关键诱因。中医认为，AMI属“真心痛”、“厥心痛”及“胸痹”等范畴，其主要病机为痰浊、瘀血阻于心脉，闭塞不痛、营气不行等，主要治法以破瘀行气及通络止痛。延胡索具有活血散瘀、理气止痛等功效，在AMI治疗方面具有独特疗效。延胡索丁素是延胡索中重要成分，本研究通过建立AMI模型大鼠并给予延胡索丁素进行干预，通过心脏超声及心肌梗死面积继而初步评价延胡索丁素的对大鼠AMI的影响。结果显示，延胡索丁素可有效改善心脏心功能指标，如：LVEF、LVEDV及LVESV，同时亦可缩小心肌梗死面积、降低心脏指数。由此提示，延胡索丁素具有缓解心肌梗死、逆转心脏重塑及改善心功能不全等功效，具有重要的开发潜质，因此后续实验开展了进一步的机制研究。

研究发现，AMI的治疗时间与治疗效果之间存在正相关性［6］，通常在AMI患者抢救治疗中，务必采用早诊断、早治疗原则，从而控制症状防范患者猝死及相关并发症的发生。传统AMI诊断主要通过对患者的心电图及其临床症状进行分析，由于该方式特异性差，易出现漏诊或误诊等情况，因此临床上开始对患者体内的心肌损伤标志物进行检测。cTnI、CK-MB及Myo作为特征性血清学标志物，在AMI诊断中具有重要的参考意义。cTnI是人体心肌细胞的一种调节蛋白，在健康人体血清中含量较低，当心肌受损时释放入血，具有较高的特异性及窗口期，其血清含量可直接表明AMI受损程度，因此被誉为心肌损伤的“金标准”，可作为心肌梗死的早期标志物。CK-MB是AMI的典型标志物，可特异性反映心肌损伤程度及治疗溶栓效果。Myo广泛分布于心肌及横纹肌，当AMI发生时可最早检测出，Myo同时也是AMI溶栓成功再灌注的考察标志物［7-8］。通过上述三项指标检测，可有效判断AMI的严重程度及相应治疗效果。通过形态学考察发现，延胡索丁素可保护、修复心肌细胞、减轻AMI后的心脏损伤，同时通过检测血清生化指标验证了延胡索丁素具有良好的改善心肌损伤作用。

炎症反应介导了AMI发生后的心肌损伤与修复的过程，通过缓解炎症反应可有效改善心肌梗死症状，降低梗死面积。本研究结果显示，延胡索丁素可有效降低心脏组织中NLPR3、ASC及Caspase-1的表达水平，同时抑制其下游IL-1β、IL-18的合成与释放。提示延胡索丁素可通过介导NLPR3/Caspase-1信号通路，减少炎症因子的释放，缓解AMI后心肌细胞的炎症性损伤。