原发性高血压相关的线粒体tRNA突变研究

余雪姣 金菊仙 董全胜 陈秀花

原发性高血压（Essential hypertension，EH）是一种原因不明、以动脉血压升高为主要临床表现的复杂性疾病，是严重的公共健康问题。高血压中90%为EH［1］，EH是一种由多因素引发的复杂性疾病，其发病机制尚未完全阐明。有研究表明，高血压是一种多基因、多因素、复杂异质性的疾病，线粒体在调节血管的各个方面起到关键的作用［2-3］。线粒体tRNA基因突变是与疾病相关的突变热点区域，已报道的与EH相关的线粒体tRNA突变有tRNAMet/tRNAGlnA4401G［4］、tRNAThr G15927A突变［5］等。为了更好的理解线粒体tRNA突变和EH的相关性，作者开展了EH患者线粒体tRNA突变筛选，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2017年1月在衢州市人民医院心内科门诊和住院的EH患者共200例，其中男150例，女50例；年龄25～70岁，平均47.5岁。纳入标准：EH的诊断符合《中国高血压防治指南2010》推荐的标准［6］。排除标准：继发性高血压、白大衣性高血压、糖尿病、甲状腺疾病、严重的肝肾功能损害、严重心律失常、恶性肿瘤、感染等疾病。此外，选取100例年龄和性别相仿的健康体检人群作为正常对照，其中男70例，女30例；年龄18～66岁，平均40.5岁。

1.2 基因组DNA提取 抽取受试者及正常对照个体外周静脉血2ml于EDTA-K2中，按照Universal Genomic DNA提取试剂盒（TakaRa 4.0）的使用说明提取DNA，-20℃保存备用。

1.3 线粒体tRNA基因组全序列分析 本研究以提取的全基因组DNA为模板进行线粒体tRNA基因组的扩增，所需引物参考前期发表的文献［7］。PCR产物经纯化后，用BigDye末端循环测序反应试剂盒在ABI 3700全自动DNA测序仪上进行测序。测序结果使用DNA Star软件与修正的人类线粒体DNA剑桥参考序列比对［8］。同时，对100例正常对照个体进行线粒体tRNA基因组扩增、测序分析，方法同上。

1.4 种系进化保守分析 通过Clustal X 软件将人类线粒体基因的变异位点与16种哺乳类动物的线粒体基因相应位点进行保守性分析，得出保守性指数（Conservation index，CI），分析这些变异位点在种系发育过程中所起的作用，其中CI＞75%被认为有功能学意义［9］。

1.5 线粒体tRNA致病性突变评估 由于线粒体tRNA的高突变率，有研究表明：大部分tRNA变异位点属于多态性［10］，因此鉴定致病性的tRNA突变尤为重要。本研究参考以下标准区分致病性tRNA突变：（1）在正常人群中的频率＜1%；（2）CI＞75%；（3）突变是否影响tRNA结构或者引起功能学的改变［11］。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件。组间两两比较使用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体tRNA突变分析 利用PCR-Sanger测序法，对200例EH患者和100例正常对照个体进行了线粒体tRNA基因组的扩增，PCR产物经过纯化后测序分析，共鉴定了3个线粒体tRNA突变可能与EH有关：线 粒 体tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G，而这些突变位点在正常对照个体中均未发现。共发现5例患者携带线粒体tRNA突变，其中2例EH患者携带A4435G突变，突变频率为1%；2例EH患者携带T4363C突变，突变频率为1%；1例患者携带A8343G突变，突变频率为0.5%。这些突变所对应的线粒体tRNA二级结构示意图如图1所示。

图1 EH相关的mt-tRNA突变二级结构示意图

2.2 携带线粒体tRNA突变的个体临床和遗传学分析 5例携带tRNA突变的患者中，男2例，女3例，发病年龄52～60岁。2例携带A4435G突变的EH患者中，女2例，无EH的家族史。2例携带T4363C突变的EH患者，男1例，女1例，均无EH的家族史。1例携带A8343G突变的EH患者为男性，无家族史。经t检验，200例EH患者和100例正常对照个体，对其线粒体tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G突变比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 线粒体tRNA突变致病性评估 根据致病性的mt-tRNA突变评估方法，作者认为：线粒体tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G属于致病性突变，可能与EH有关（见表1）。

表1 EH相关的线粒体tRNA变异位点分析

3 讨论

本研究对EH相关的线粒体tRNA突变的筛查，经过PCR扩增，基因测序比对后共发现3个可能与EH有关的突变位点：tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G。从结构上来看，A4435G突变位于tRNAMet的第37位点，与反密码子毗邻，该位点在进化上高度保守［12］。与其他位点相比，第37位点更易被修饰，修饰后的该位点在反密码子识别的高保真度和维持tRNA三级结构及生化功能的稳定性方面均起重要的作用［13］。前期研究表明：携带A4435G突变的个体线粒体tRNAMet的稳定性下降了约40%，由此而造成的线粒体蛋白翻译水平也下降了约50%，引起ATP合成减少，ROS 水平明显增高［14］。

T4363C突变位于tRNAGln二级结构反密码子环的38号位点，线粒体tRNAGln为重链编码tRNA，其在16种灵长类及鼠、牛和爪蟾等物种中是高度保守的。Wong等［15］在一例发育迟缓、胃肠反流、视网膜炎发育不良和感音神经性耳聋女性儿童患者中发现了此突变，并证实T4363C是一个同质性突变。二级结构预测中上述致病性突变通过与相对应的32位形成W-C碱基配对，延长反密码子茎缩小反密码子环，破坏tRNA合成酶识别和密码子的配对，造成tRNA功能障碍，降低线粒体蛋白合成率引起线粒体功能障碍，引起疾病产生。T4363C突变可能对反密码子识别的高保真性产生影响，从而参与疾病的发生［16］。

A8343G突变位于tRNALys基因的T环上，对tRNALys的稳定性起着重要的作用。该突变可能导致tRNA代谢下降，影响tRNA的翻译进而影响蛋白稳定合成。此外，A8343G突变可能降低tRNA-氨基酰化与延长因子Tu（EF-Tu）结合效率，从而影响tRNA的修饰［17］。此外，A8343G突变还参与了线粒体内膜ATP-敏感钾通道的合成，从而影响其活性及线粒体K+的传送［18］。

综上所述，本研究发现线粒体tRNA突变可能与EH有关，A4435G、T4363C和A8343G突变会导致线粒体tRNA代谢障碍，引起蛋白合成受阻，最终造成线粒体功能损伤，进而参与了EH的发生发展。本研究的缺陷是标本量较少，后续的工作还要扩大样本量。