NLRP3炎性小体基因多态性与慢性牙周炎易感性的相关性研究

陈幸 丁成 傅淑蕾 张鹏涛 张远 钟良军

牙周炎是由菌斑微生物引起的一种慢性感染性疾病，影响世界上约20%～50%的人口［1］。该病是由细菌入侵牙周组织，激活宿主免疫炎症反应和持续的免疫反应不平衡，导致渐进性牙周组织损伤［2］。研究表明，遗传因素在决定宿主的免疫反应方面可能起一定的作用［3］，此外，吸烟、性别以及糖尿病和冠心病等全身系统性疾病也会造成疾病易感性的个体差异。NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含热蛋白结构域亚成员，被证明参与慢性感染炎症性疾病的先天免疫反应［4］。在牙周炎患者中观察到牙龈组织中NLRP3的过表达和唾液水平NLRP3的增加［5］。基于抑制NLRP3炎性小体的治疗方法在实验性糖尿病牙周炎的治疗中也取得了显著的疗效［6］。一项基于哥伦比亚人群的研究表明，NLRP3（rs4612666）基因型与老龄和吸烟习惯的协同作用可能影响慢性牙周炎（Chronic Periodontitis，CP）的发病［7］。但不同种族群体牙周炎的遗传易感性存在差异，而目前国内尚未见该基因座位的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与牙周炎易感性相关性研究的报道。因此，本研究拟探索NLRP3（rs4612666）基因多态性对中国人群CP发病的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年12月至2018年12月本院牙周病诊疗中心就诊的236例中重度CP患者（病例组，CP组），根据美国牙周病学会（AAP，1999）的牙周炎诊断标准，使用牙周刻度探针（Hu-Friedy，UNC-15）分别在每颗牙齿颊舌面的远中、中央、近中进行测量，并沿着牙周袋底提插式行走，记录的临床参数包括：牙周探诊深度（Periodontal Probing Depth，PD）、临床附着丧失（Clinical Attachment Loss，CAL）和全口探诊出血指数（Full-Mouth Bleeding Score，FMBS）。中 度 CP为 PD 5～6mm，CAL 3～4mm；重 度 CP为PD≥7mm，CAL≥5mm。排除标准：吸烟者或戒烟时间＜10年者；糖尿病、风湿病等全身系统性疾病者；近1年内有牙周治疗史者；错颌畸形者；孕妇或哺乳期者。对照组通过多阶段随机抽样方法从本院体检中心抽取患有局部牙龈炎或牙周健康的对照，并且按年龄、性别与病例组进行匹配。所有对照组经过牙周检查无PD≥4mm的牙周袋且FMBS＜20%。本研究得到了杭州师范大学附属医院伦理委员会的批准。

1.2 样本收集 所有观察对象均签署知情同意书，均抽取前臂外周血5ml保存于EDTA抗凝管中。在-20℃下放置过夜后保存于-80℃冰箱，留待提取DNA。

1.3 DNA提取和基因分型 采用DNA提取试剂盒 提 取 DNA（TIANGEN，TIANamp Geomic DNA Kit）。使用聚合酶链反应-限制片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 方 法 对 NLRP3 rs4612666基因多态性进行基因分型。引物序列为上 游：5'-TGCTTAAGGCCATTAATTGTG-3'， 下 游5'-CTCCACCATGGACAAGGAAG-3'，扩增长度为260bp。PCR反应体系：混合物总反应体积为15μl，包含1μl DNA、上下游引物各 0.5μl、DreamTaq Green PCR Master Mix（2X）（Thermo Fisher）8μl和 5μl灭菌双蒸水。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察条带。PCR和酶切反应设置空白对照项，基因多态性的分型检测均在盲法原则下完成，并随机抽取10%样本进行重复性测试2次，验证结果的可靠性。

1.4 统计学方法 SNP Stats软件用于评估哈迪温-伯格平衡（Hardy-Weiberg，HWE，P＞0.05）。使用SPSS 25.0分析实验数据。NLRP3 rs4612666位点的基因型和等位基因频率的分布比较计算比值比（OR）及95%可信区间（95% CI），当可信区间不包括1.0时存在相关性，采用χ2检验统计实验结果，所有检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CP组和正常对照组（HC组）临床资料比较 见表1。

表1 CP组和HC组临床资料比较（）

表1 CP组和HC组临床资料比较（）

CP组（n=236） HC组（n=191） P值性别（n） 男性 107 101 0.12女性 129 90 -年龄（岁） 均数 48.31±9.65 46.57±8.59 0.53范围 33～65 31～62 -探诊深度（mm） 4.36±0.52 2.37±0.31 ＜0.001临床附着丧失（mm） 4.92±0.78 2.51±0.25 ＜0.001程度（n） 中度CP 85 - -重度CP 151 - -

2.2 NLRP3基因rs4612666位点的基因型和等位基因频率分布 CP组和HC组的NLRP3（rs4612666）最小等位基因频率（Minor Allele Frequency，MAF）和基因型分布见表2。经HWE检验，基因型和等位基因分布频率符合HWE（χ2=2.87，P=0.09）。二次随机选择的重复试验结果与对应原始结果比较的符合率为100%。根据性别和CP严重程度分组的rs4612666位点的基因型分布情况见图1。

表2 NLRP3（rs4612666）C/T基因型分布及最小等位基因频率［n（%）］

图1 rs4612666位点的基因型分布情况。A：NLRP3（rs4612666）位点各基因型在中度和重度慢性牙周炎患者中的分布；B：NLRP3（rs4612666）位点各基因型在男性和女性慢性牙周炎患者中的分布

2.3 NLRP3基因rs4612666位点的基因型和等位基因频率分布比较 所有CP患者和对照组之间进行各基因型和等位基因的频率对比分析，表3显示NLRP3 rs4612666位点携带T等位基因的人群，患CP的风险显著增高（CT vs. CC：OR=2.09，95% CI=1.09～4.03，P=0.026；TT vs. CC ：OR=2.86，95% CI=1.24～6.59，P=0.013；CT/TT vs. CC：OR=2.27，95% CI=1.21～4.25，P=0.010；T等位基因 vs. C等位基因：OR=1.50，95%CI=1.14～1.97，P=0.003）。当单独对男性 进 行 分析时，CP组 NLRP3 rs4612666位 点 的 CT、TT及 CT/TT基因型与CC基因型携带者比较，患CP的风险均 增 高（OR=2.09，95% CI=1.09～4.03，P=0.026；OR=2.86，95% CI=1.24～6.59，P=0.013；OR=2.27，95% CI=1.21～4.25，P=0.010），且T等位基因与C等位基因比较（OR=1.64，95% CI=1.11～2.43，P=0.012）患病风险显著增加。在女性组未观察到任何基因型和等位基因频率分布的差异。当根据患者CP的严重程度（中度和重度）进行分组分析时，未发现差异有统计学意义（见表3）。

表3 NLRP3（rs4612666）C/T位点各基因型与慢性牙周炎风险的相关系分析结果

3 讨论

为了更好了解牙周炎复杂的免疫发病机制，本病例对照研究分析了炎性小体NLRP3 rs4612666基因多态性与牙周炎易感性的相关性。虽然已经有研究报道非亚洲人种NLRP3 rs4612666基因多态性与CP的关系［7］，本文是第一次针对此SNP在中国人群中牙周炎易感性的病例对照研究。作者进行了严格的观察对象筛选和基因分型，结果发现，NLRP3（rs4612666）位点CT和TT基因型与CP的遗传易感性有关，尤其在男性人群中相关性显著，但与牙周炎的严重程度无关。

NLRP3突变等位基因C是1q44号染色体内含子7上的一个单核苷酸突变，与野生等位基因T比较，该等位基因的转录活性更高。NLRP3的激活取决于通过模式识别受体PRRs识别病原相关分子模式PAMPs提供的信号，如微生物脂多糖（LPS）。为了证实这一生物学机制，大量体外研究表明牙龈卟啉单胞菌（Pg）、伴放线聚集杆菌（Aa）和聚核梭杆菌（Fn）等牙周致病菌参与了NLRP3的表达增加［8］。NLRP3的高表达刺激IL-1β和IL-18的分泌和成熟。NLRP3的诱导还涉及细胞死亡或损伤释放的内源性宿主因子，如ATP等。因此，除了病原体引起的NLRP3激活信号外，还应考虑与NLRP3基因转录活性增高相关的基因多态性在牙周炎发病炎症相关信号通路中的作用。

环境危险因素与CP的发生发展密切有关，如吸烟习惯和性别等。与从不吸烟的人比较，吸烟人群患CP的风险更高，因吸烟会引起免疫抑制和细胞功能受损，如成纤维细胞促进的组织修复，因此吸烟人群通常CP的严重程度更重，对牙周治疗的反应也较差［10］。本资料中，为了最大可能的避免偏倚，仅纳入了非吸烟人群，以降低吸烟混杂因素的影响。此外，由于激素水平、口腔卫生和不良的健康预防习惯等因素的性别差异，许多免疫基因遗传变异被认为是男性CP发生的易感因素，因此，按1∶1进行性别匹配病例组和对照组。

本资料中，作者发现NLRP3 rs4612666位点CT和TT基因型与增高的男性CP的风险相关。截止目前，有两项研究调查了NLRP3基因多态性对牙周炎的影响［7，9］。其结果与作者相似，本研究考虑到性别差异，也按性别进行了亚组分析，发现与女性比较，非吸烟男性CP患者的CT、TT基因型分布频率更高（P＜0.05）。此外，作者又按照CP严重程度进行了亚组分析，以研究NLRP3 rs4612666位点与牙周炎发展阶段的关系，与健康对照组比较，中度CP和重度CP患者中均未观察到相关性，提示NLRP3 rs4612666基因多态性可能与牙周炎的发病关系更为密切，而与牙周炎的进展相关性不大。

本研究尚存在一些不足。首先，本研究纳入样本量相对较小，CP是多因素疾病，单基因SNP对牙周炎易感性的影响相对较小，可能需要大样本量的病例对照研究才可以发现潜在的相关性。同时，协同相互作用在CP的致病途径中发挥重要作用，因此多基因多SNP的基因-基因研究以及环境-基因协同作用研究可以更好的发现遗传因素在CP发病中的作用。

综上所述，男性NLRP3 rs4612666位点CT或TT基因型者可能罹患牙周炎的风险增高。将来，有必要在独立的大样本人群中对我们的结果进行重复研究以验证这些关联。