委陵菜酸改善前列腺癌的作用及机制研究

黄航 叶雪挺 杨宇 陈伟

前列腺癌是男性泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。在美国每年约有22万例新增患者［1］，而我国前列腺癌患者发病率约为60.3/10万，死亡率高达26.6/10万［2］，严重影响老年男性的生活质量，给社会家庭带来巨大负担［3］。通过手术、放疗、化疗及内分泌干预等方法对前列腺癌患者进行治疗，但其疗效不佳、周期长、复发率高等特点，严重影响患者的治疗效果及生命安全。因此，积极探索高效、低毒的抗癌新药对提高患者生命健康具有重要意义。蛇莓是蔷薇科植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）Focke的干燥全草，始载于《别录》，其味甘、性苦寒，具有清热解毒、散瘀消肿等功效，近年来其抗肿瘤活性日益获得关注。本课题拟选用蛇莓中活性代表成分委陵菜酸作为研究对象，分别建立体内、体外实验模型，对委陵菜酸在前列腺癌治疗方面的作用及机制开展深入研究，为前列腺癌患者的治疗提供新的有效方法，为传统中草药蛇莓的临床应用补充科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人前列腺癌LNCaP细胞，购自美国模式培养物保存中心（ATCC）。细胞培养在RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清），随后置入含5% CO2的37℃培养箱，每天进行一次换液。

1.2 动物 SPF级雄性BALB/c-nu裸鼠（20.5～21.5g）40只，6周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK（京）2018-008］。裸鼠置于层流架中饲养。采用无特定病原体的饲料饲喂，温度（23±2）℃，湿度45%～65%，维持10h光照、14h黑暗交替。

1.3 实验试剂及仪器 委陵菜酸（HPLC≥98%，PRF7042741），购自上海将来实业股份有限公司；Gemini胎牛血清，购自美国Gemini公司；RPMI-1640培养基，购自美国Hyclone公司；PSA、PPARβ、Twist1、E-cadherin、N-cadherin、vimentin及β-Tubulin抗体，购自美国Cell Signaling公司；HRP标记抗兔二抗、蛋白抽提试剂盒及ECL发光液，购自江苏碧云天生物技术公司；倒置显微镜，日本Olympus公司产品；电子天平，美国Sartorius公司；细胞超净工作台，苏州尚田生物技术公司；酶标仪，购自美国Biotek公司，Western blot转膜系统、Gel Doc凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；垂直电泳装置，美国Bio-Rad公司。

1.4 方法 （1）划痕实验：取对数生长期的LNCaP细胞置入6孔板中进行培养，待细胞融合至80%～90%时用200μl移液枪头在中间划直线，确保每次划痕宽度一致。采用无菌PBS液清洗孔内脱落细胞，再加入完全培养基进行培养并加入不同浓度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸进行干预。分别在划痕0h及24h后置显微镜下进行观测，评估细胞迁移情况，并根据划痕愈合率对给药前后细胞迁移能力进行考察。（2）Transwell侵袭实验：取对数生长期的LNCaP细胞，将其稀释至5×104浓度后取200μl加入包被有Matrigel的Transwell上室，各组孔内分别滴加不同浓度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸进行干预，同时在下室中加入完全培养基，随后放置在细胞孵育箱中继续培养24h。培养结束，用棉签轻柔擦净上室面未穿过膜层的LNCaP细胞，并置入甲醛进行固定。20min后常温晾干，采用结晶紫染色20min，用预冷的PBS进行清洗，并放置显微镜下进行观测。（3）细胞内蛋白收集：取对数生长期的LNCaP细胞加入培养皿中进行培养，待细胞融合至80%～90%时进行清洗、换液，并滴加不同浓度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸进行干预，待培养24h后收集细胞，加入裂解液进行低温裂解。随后收集至EP管中，根据12000r/min，4℃的条件离心5min，收集管内上清液，分装并保存于-80℃。（4）移植瘤模型建立［4］与给药：收集对数生长期的LNCaP细胞，将其稀释至2×107个/ml密度的细胞悬液。取健康BALB/c-nu裸鼠，术前12h禁食不禁水，用乙醚进行吸入麻醉，仰卧位固定其头部与四肢，下腹部消毒。随后切开皮肤分离腹膜，用无菌棉签推开膀胱使生殖腺叶状肉红色的左右叶前列腺腺体充分暴露。将25μl制备好的LNCaP细胞悬液注射在前列腺腺体的背外侧薄膜内。还原各组织器官位置，关闭腹腔、分层缝合皮肤。2周后，取造模裸鼠随机分为移植瘤组、委陵菜酸低剂量（0.75mg/kg）组、委陵菜酸中剂量（1.50mg/kg）组及委陵菜酸高剂量（3.00mg/kg）组。各组灌胃相应剂量药物，移植瘤组给予等量生理盐水，累计给药4周。实验结束，处死裸鼠并摘取前列腺腺体，剥离其中瘤组织待滤纸吸干后称质量（M）。测量瘤体的长（a）、短（b）径。根据公式计算抑瘤率（%）=（M移植瘤组-M给药组）/M移植瘤组×100%，瘤体积=（a×b2）/2。随后将部分前列腺癌组织置入10%甲醛溶液固定。剩余部分组织剪碎，加入裂解液后匀浆。在4℃条件下12000r/min离心30min，取上层液至样品管中，分装后放置-80℃下保存。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 委陵菜酸对前列腺癌细胞迁移及侵袭能力的作用 划痕实验结果显示：与0μmo/L组比较，不同浓度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸干预处理后，细胞迁移距离明显缩减（P＜0.05，P＜0.01），其中以20μmo/L及40μmo/L的干预作用最强（P＜0.01）。结果见图1。Transwell小室法结果表明：与0μmo/L组比较，不同浓度（20、40μmol/L）委陵菜酸干预处理后，细胞侵袭数量显著减少（P＜0.05，P＜0.01），而10μmol/L组与0μmol/L组之间无明显差异（P＞0.05）。结果见图2。

图1 委陵菜酸对LNCaP细胞迁移的影响

图2 委陵菜酸对LNCaP细胞侵袭的影响

2.2 委陵菜酸对前列腺癌细胞中信号通路相关蛋白表达的作用 WB检测细胞蛋白结果显示：在PPARβ、Twist1、N-cadherin和Vimentin表达方面，与0μmol/L组比较，不同浓度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸可明显下调其表达水平（均为P＜0.05）；在E-cadherin表达方面，与0μmol/L组比较，不同浓度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸可明显上调前列腺癌细胞中E-cadherin的表达水平（P＜0.05，P＜0.01），其中以20及40μmol/L委陵菜酸作用能力最强（P＜0.01）；结果见图3。

图3 委陵菜酸对LNCaP细胞中相关蛋白表达的影响

2.3 委陵菜酸对前列腺癌裸鼠移植瘤的作用 在前列腺癌细胞裸鼠移植瘤模型中，采用不同浓度（0.75、1.5、3mg/kg）委陵菜酸给药治疗后，各组肿瘤质量及体积均出现了下降趋势，与0mg/kg组比较差异明显（P＜0.05，P＜0.01）。结果见图 4。

图4 委陵菜酸对裸鼠移植瘤的影响

3 讨论

前列腺癌晚期患者通常采用雄激素去势治疗（androgen deprivation treatment，ADT）的治疗方式，随着治疗的进行而发展为去势抵抗性前列腺癌。研究发现，肿瘤转移是前列腺癌患者死亡的重要原因，局限性前列腺癌患者的5年生存率可达100%，但一旦发生转移其5年生存率仅为31%［5］。而上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）在前列腺癌患者的肿瘤转移与治疗抵抗过程中起到关键作用，部分残留的前列腺癌细胞在经过激素疗法后可表现出EMT表型。EMT能促进上皮细胞极性消失、粘附能力降低，继而转化成具有移动能力的间质细胞，导致细胞间紧密连接消失、细胞获得迁移能力与侵袭能力。由此可知，抑制前列腺癌细胞的EMT进程对提高患者的生命具有重要意义。近年来，天然产物在抗肿瘤方面表现出明显优势，通常具有疗效强、毒副作用弱及不易产生耐药性等特点，尤其在前列腺癌治疗方面表现出独特潜力。

研究表明，肿瘤细胞处于EMT进程时其上皮细胞表型标志物（E-cadherin）表达受到抑制，而间质细胞表型标志物（N-cadherin、vimentin）表达显著增加，继而使细胞间连接丢失、移动能力提升［6］。细胞实验结果发现，委陵菜酸可有效削弱前列腺癌细胞的迁移及侵袭能力，抑制癌细胞中N-cadherin、vimentin的表达，促进E-cadherin表达。由此提示，委陵菜酸可通过调控EMT进程，从而抑制前列腺癌细胞迁移、侵袭。Twist1是EMT进程中重要的触发因子，可调控E-cadherin或N-cadherin的表达［7］。Twist1在常见的各类肿瘤发生、发展过程中几乎均有表达，在肿瘤EMT进程及药物抗性方面发挥关键作用［8］，而最新研究显示Twist1亦参与了PPARβ的信号传导［9］。PPARβ属PPAR核激素受体超家族，体内分布广泛，通常参与脂类代谢、胚胎移植及肿瘤形成等生理病理过程，同样在前列腺癌中呈高表达状态，是抑制前列腺癌细胞的重要靶点。实验结果发现，委陵菜酸可有效降低癌细胞中PPARβ及Twist1的表达水平，由此表明委陵菜酸对EMT的调控作用是通过介导PPARβ/Twist1信号传导继而发挥出来的。最后在人前列腺癌裸鼠移植瘤模型中，作者观察到委陵菜酸可明显降低肿瘤的质量与体积，阻断肿瘤组织的疾病进展，此处研究结果与体外细胞实验一致。

综上所述，委陵菜酸可有效抑制PPARβ/Twist1信号通路，从而缓解前列腺癌细胞EMT进程，下调其迁移与侵袭的能力。同时本实验从体外研究转向体内研究，充分验证了委陵菜酸抗前列腺癌的药理活性及作用机制。因此，通过本研究为前列腺癌的临床治疗提供潜在策略，亦为蛇莓的传统应用补充了科学数据。