消退素D1调节巨噬细胞自噬对实验性结肠炎小鼠的影响

余沛君，方 晨，梅咏玉，杨 彬，刘晓昌，许建明，梅 俏

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是临床常见的慢性消化道疾病，复发性高，其发生发展与炎症免疫反应的失调密切相关[1]。研究[2]表明巨噬细胞参与IBD。相关分子模式经识别后，触发NF-κB信号通路激活和炎症体活化，促进炎症因子合成[3]。炎症反应产生的线粒体活性氧等物质通过细胞自噬清除，维持机体稳态[4]。自噬流的动态过程出现障碍，将导致自噬受限，加重炎症发生发展过程。因此，自噬可能通过不同机制调控机体炎症过程。消退素D1(resolvin D1，RvD1)是一种多不饱和脂肪酸衍生物，具有抗炎作用。Bento et al[5]、Liao et al[6]研究提示RvD1可以减轻机体炎症反应，但RvD1影响结肠炎的作用机制尚不清楚。该研究通过RvD1对实验性结肠炎小鼠自噬的影响，探究RvD1对结肠炎的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与动物

1.1.1实验动物 C57BL/6雄性小鼠32只，体质量(20±2)g，由安徽省动物中心提供。标准环境饲养1周。

1.1.2主要药品与试剂 葡聚糖硫酸钠购自美国Sigma公司；RvD1购自美国Cayman公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin 1，IL-1)、IL-6、IL-10等的ELISA试剂盒购自武汉新启迪生物科技有限公司；MPO试剂盒购自南京建成生物工程研究所；抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1抗体购自美国Abcam公司；抗诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、IL-1β前体、溶酶体相关膜蛋白2 (lysosomal-associated membrane protein 2，Lamp2)抗体购自北京Bioss生物科技有限公司；抗β-actin抗体购自北京市中杉生物科技有限公司；DNA合成试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；荧光定量PCR试剂盒购自德国Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1分组 将小鼠采用随机分组法均分为正常对照组、RvD1对照组、模型对照组和RvD1给药组。对正常对照组及RvD1对照组小鼠，让其自由饮用等量蒸馏水处理；对模型对照组及RvD1给药组小鼠，让其自由饮用由实验室制备的5% DSS溶液处理，搭建实验性结肠炎模型[7]。RvD1溶于含3% DMSO的生理盐水，浓度为50 μg/kg。实验第2、4、6天，RvD1对照组和RvD1给药组腹腔注射RvD1，正常对照组和模型对照组腹腔注射等体积含3% DMSO的生理盐水。实验7 d后处死小鼠，留取小鼠结肠组织待测，同时制备腹腔巨噬细胞。

1.2.2小鼠结肠炎严重程度评价 用疾病活动指数(disease activity index，DAI)进行实验评分[8]，评价各组小鼠结肠炎严重程度。取小鼠结肠组织HE染色，光学显微镜下观察，进行组织学损伤指数(histological index，HI)评分[9]。

1.2.3腹腔巨噬细胞分离提取和透射电镜观察 按文献[10]方法，PBS溶液冲洗小鼠腹腔，灌洗液离心后在RPMI-1640完全培养基(含10% FBS和1%青-链霉素)中进行细胞培养。经PBS洗涤，收集的黏附细胞即为腹腔巨噬细胞。将腹腔巨噬细胞离心，固定，脱水，环氧丙烷处理，包埋，切片，于电镜下观察腹腔巨噬细胞内自噬体结构。

1.2.4ELISA法检测各组结肠组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和细胞因子含量 结肠组织匀浆离心取上清液，检测结肠组织中MPO、IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α含量。

1.2.5qPCR法检测小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β、iNOS及自噬相关基因mRNA的表达 取小鼠腹腔巨噬细胞，提取总RNA，经DNA合成试剂盒辅助，促进RNA生物反转录为cDNA。经实时荧光定量PCR试剂盒开始PCR。该生化反应过程需要如下基本条件：95 ℃、2 min；95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，共计40个反应循环。根据实验结果绘制扩增曲线，产生熔解曲线，以β-actin基因作为内参，用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。引物的主要序列情况见表1。

1.2.6Western blot法检测小鼠腹腔巨噬细胞中iNOS、IL-1β及自噬相关蛋白的表达 将小鼠腹腔中的巨噬细胞取出并进行离心操作，PBS洗涤3次弃上清液，加入裂解液，离心收集上清液，SDS-PAGE凝胶电泳转移至PVDF膜，封闭2 h。膜与一抗4 ℃孵育过夜，一抗为：LC3-Ⅰ(1 ∶10 000)；LC3-Ⅱ(1 ∶900)；LAMP2(1 ∶300)；Beclin1(1 ∶1 000)；p62(1 ∶300)；IL-1β(1 ∶300)；pro-IL-1β(1 ∶300)；iNOS抗体(1 ∶300)。PBST洗膜3次，加入一定量的辣根过氧化物酶进行二抗标记，在室温条件下孵育，并进行3次PBST洗涤，显影。该实验以β-actin作为内参，应用ECL发光试剂盒对蛋白检测，应用ImageJ软件系统分析评价蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 RvD1对实验性结肠炎小鼠肠道炎症的影响相比较正常对照组，模型对照组DAI评分提升，HI评分有所增加，MPO含量上升，与模型对照组比较，RvD1给药组DAI评分、HI评分和MPO含量减低(P<0.05)，见图1A、B、C。结肠组织病理学观察发现模型对照组结肠组织可见大量炎性细胞浸润，黏膜上皮细胞形态改变，杯状细胞、隐窝减少；RvD1给药组结肠组织炎性细胞浸润减少，隐窝数量基本正常。见图1D。

2.2 RvD1对实验性结肠炎小鼠结肠组织细胞因子含量的影响相比正常对照组，模型对照组小鼠结肠组织IL-1、IL-6、TNF-α的含量提升，IL-10水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。相比较模型对照组，在RvD1给药组中，小鼠结肠组织IL-1、IL-6、TNF-α的水平降低，IL-10含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 实时荧光定量PCR法引物序列

表2 RvD1对实验性结肠炎小鼠结肠组织细胞因子含量的影响

与正常对照组比较：*P<0.05;与模型对照组比较：#P<0.05

2.3 RvD1对实验性结肠炎小鼠腹腔巨噬细胞自噬体结构的影响在实验中通过透射电镜观察小鼠腹腔巨噬细胞并对巨噬细胞自噬泡体积分析可以发现，相比较正常对照组，模型对照组自噬泡体积增大，RvD1给药组小鼠腹腔巨噬细胞内自噬泡与模型对照组相比较体积缩小，见图2。

2.4 RvD1对实验性结肠炎小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β、iNOS及自噬相关表达的影响相比较正常对照组，在模型对照组中，小鼠腹腔巨噬细胞内Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA及其蛋白表达量降低，iNOS、IL-1β、p62 mRNA及其蛋白表达量增加(P<0.05)。与模型对照组比较，RvD1给药组小鼠腹腔巨噬细胞内Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA及其蛋白表达量提升，iNOS、IL-1β、p62 mRNA及其蛋白表达量降低(P<0.05)。见图3。

3 讨论

IBD是一种肠道慢性复发性炎症性疾病，近年来发病率逐渐增高并且病程反复、难以治愈。目前主要临床治疗用药5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等存在药物不良反应，开发新型高效安全的药物十分重要。

图1 RvD1对DSS结肠炎小鼠肠道炎症的影响

A：各组小鼠每日DAI变化比较；B：各组小鼠每日HI变化比较; C：各组小鼠每日MPO变化比较；D：各组小鼠结肠组织病理变化(HE染色×400)； 1：正常对照组；2：RvD1对照组；3：模型对照组；4：RvD1给药组；与正常对照组比较：*P<0.05；与模型对照组比较：#P<0.05

图2 RvD1对实验性结肠炎小鼠腹腔巨噬细胞自噬体结构的影响 ×200A:正常对照组；B：RvD1对照组；C：模型对照组；D：RvD1给药组

图3 RvD1对实验性结肠炎小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β、iNOS等自噬相关表达的影响

A：各组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β、iNOS、Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的蛋白表达水平；B：各组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β、iNOS、Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的mRNA表达水平；1：正常对照组；2：RvD1对照组；3：模型对照组；4：RvD1给药组；与正常对照组比较：*P<0.05；与模型对照组比较：#P<0.05

RvD1是一种具有抗感染作用的多不饱和脂肪酸衍生物，Bento et al[5]、Liao et al[6]研究提示RvD1可以减轻机体炎症反应，但RvD1对结肠炎的作用尚不清楚。本实验中RvD1给药组DAI评分、HI评分和MPO含量低于模型对照组，RvD1给药组结肠黏膜炎性细胞浸润减少。同时结肠组织内IL-1、IL-6、TNF-α含量降低，IL-10含量提升。将RvD1应用于结肠炎中可以改善肠道炎症损伤。

自噬是一类高度保守的降解途径，机体炎症过程中产生的线粒体活性氧等物质，可以通过细胞自噬达到清除，维持机体的稳态[4]。当自噬受到限制时，mtDNA释放，活性氧产生和P62堆积，触发NF-κB信号通路激活和炎症体活化，促进炎症因子合成，加重器官炎症损伤。当自噬受损时细胞内可形成较大的液泡，自噬泡的半衰期延长[11]。本实验显示模型对照组小鼠腹腔巨噬细胞内可见自噬泡数量增多及自噬泡体积增大，提示自噬通路受损。给予RvD1处理，自噬泡数量减少。在自噬体形成的过程中，Beclin1与Vps34结合形成Beclin1-Vps34-Vps15复合体，介导自噬泡定位，促使自噬前体形成[12]。LAMP2作为溶酶体膜上高度表达的蛋白，在自噬体与溶酶体的融合过程中发挥重要作用[13]。LC3总量一般不会变动，可由自噬溶酶体降解导致LC3-Ⅱ减少或LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ之间的相互转化，反映自噬流状态[14]。当LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值减小表示自噬受限或自噬过度活化，比值增大表示自噬活化。P62在细胞自噬中起着识别以及转运待降解底物的重要作用，自噬抑制时P62含量增加[15]，自噬活化时P62水平降低。本研究显示模型对照组小鼠Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平减低，iNOS、IL-1β、p62表达增加，提示自噬受损，RvD1组小鼠巨噬细胞自噬相关蛋白异常表达改善。在结肠炎中应用RvD1可以进一步抑制炎症发生的相关机制，也许与修复小鼠细胞自噬通路，调控促炎细胞因子表达有关，这为IBD的药物治疗提供新的实验依据。