枇杷果实中NAD MDH基因克隆及植物表达载体构建

寇燕 杨俊 高欢欢 陈旭 郭傲 郑国华

摘 要：为探索枇杷果实中苹果酸的积累与降解机制，从枇杷果实转录组中得到NAD MDH的开放阅读框的基因序列。以枇杷高酸品种解放钟和低酸品种白梨为材料，提取果实中总RNA，运用RT PCR技术克隆出枇杷果实中苹果酸合成酶基因NAD MDH，并进行荧光定量PCR分析。结果表明：枇杷果实中苹果酸合成酶基因NAD MDH的开放阅读框（ORF）为996 bp，共编码了332个氨基酸。经荧光定量PCR分析，解放钟和白梨在花期后95 d时NAD MDH基因表达量最高;花后80～105 d，NAD MDH基因在高酸与低酸品种间存在显著差异。采用无缝克隆技术成功构建了植物表达载体EjNAD MDH PBI121，并导入根瘤农杆菌EHA105中得到植物转化工程菌，为后期利用转基因技术改良枇杷果实品质及遗传改良打下基础。

关键词：枇杷;NAD MDH基因;基因克隆;表達分析;载体构建

中图分类号：S667.3 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）04-0001-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.04.001

Cloning of NAD MDH Gene in Loquat Fruit and the Construction of Plant Expression Vector-

KOU Yan， YANG Jun， GAO Huan huan， CHEN Xu， GUO Ao， ZHENG Guo hua*

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University/Institute of Storage Science and Technology ofHorticultural Products， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： In order to explore the accumulation and degradation mechanism of malic acid in loquat fruit， the gene sequence of the open reading frame of NAD MDH was obtained from the transcriptome of loquat fruit. By taking Jiefangzhong （the high acid variety of loquat） and Baili （the low acid variety of loquat） as the materials， the total RNA was extracted from the fruit， and the NAD MDH gene of malate synthetase in loquat fruit was cloned by RT PCR， and then the fluorogenic quantitative PCR analysis was conducted. The results showed that the open reading frame （ORF） of the NAD MDH gene of malate synthetase in loquat fruit was 996 bp， encoding 332 amino acids. The fluorescence quantitative PCR analysis showed that the gene expression of NAD MDH was the highest in Jiefangzhong and Baili at 95 d after flowering， while the NAD MDH gene showed significant difference between the high acid and low acid varieties at 80-105 d after flowering. The plant expression vector EjNAD MDH PBI121 was successfully constructed by the seamless cloning technology， and then was introduced into the agrobacterium tumefaciens EHA105 to obtain the engineering bacteria for plant transformation， which laid a foundation for the later use of transgenic technology to improve the quality and genetic improvement of loquat fruit.

Key words： Loquat; NADMDH gene; Gene cloning; Expression analysis; Vector construction

枇杷是我国的原产果树，其产量、面积均居世界第一[1]。枇杷果肉柔软多汁，风味独特，并且具有润肺、 止渴等作用，一直以来都深受人们喜爱。枇杷果实成熟时期在春末夏初，此时正值水果淡季，因此具有较强的市场竞争力[2]。枇杷果实酸度偏高是影响其效益的主要问题，果实中有机酸的种类及质量分数是影响果实品质的重要因素之一[3]。根据水果果实在成熟过程中有机酸的积累可以分为3种类型：柠檬酸型、苹果酸型、酒石酸型，枇杷果实属于苹果酸型的水果[4]。虽然枇杷果实中调控酸性的性状基因是一对主效基因（Ma/ma），但其果实中苹果酸的积累还需要通过苹果酸代谢来实现，cyNAD MDH基因是调控苹果酸合成途径的关键基因[5]。王鹏飞[6]从欧李果实的转录组中克隆出MDH基因，其研究结果表明MDH基因表达量差异是高低酸品种间苹果酸积累差异的重要原因之一。姚玉新等

[7]克隆出苹果果实中的cyMDH基因，并且通过原核表达鉴定其功能。任磊等[8]等已成功克隆得到牡丹的PsMDH基因，成功构建正义植物表达载体。但对于枇杷果实中cyNAD MDH基因的克隆及载体构建仍然未见报道。本试验采用RT PCR技术克隆出NAD MDH基因的ORF，并且通过生物信息学工具分析NAD MDH基因的序列特征。利用qRT PCR技术对枇杷高酸品种解放钟和低酸品种白梨果实不同发育阶段的表达量进行检测，分析两品种之间基因表达量的差异。采用无缝克隆技术构建植物表达载体EjNAD MDH PBI121导入农杆菌EHA105中，获得转基因菌株，旨在为鉴定NAD MDH基因的功能提供参考，同时也为进一步研究枇杷果实中调控苹果酸代谢基因及遗传改良提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

供试枇杷果实采自莆田市常太镇果园，枇杷树为10年生，选取盛花期一致的解放钟和白梨2个枇杷品种各3株，从幼果直至成熟，每隔2周采样1次，每次两个品种各采30个果实。采后迅速去皮用锡箔纸包好于液氮中速冻，保存于-80℃冰箱中以备提取RNA。

RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒及质粒快速提取试剂盒均购于天根生化科技（北京）有限公司;In Fusion HD Cloning kits、Xba I和Sca I限制性内切酶、PrimeScript TMRT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR○RPremix Ex TapTM购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司;农杆菌EHA105、大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α感受态细胞和HiFi酶、dNTP等均购自北京全式金生物技术有限公司;pBI121载体由本实验室提供，所有引物由华大基因生物有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 枇杷果实RNA提取和cDNA合成 严格按照天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的说明书进行操作，采用1%琼脂糖凝胶电泳和Thermo Scientific Nano Drop 2000c检测提取RNA质量和浓度。以枇杷果实总RNA为模板，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser合成cDNA。

1.2.2 EjNAD MDH基因克隆 根据已有枇杷RNA seq数据库筛选得到NAD MDH基因保守区的核苷酸序列，设计NAD MDH基因引物（表1），取逆转录产物1 μL为模板，建立25 μL如下PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL;dNTP Mixture（10 mmol·L-1）0.5 μL;上、下游引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL;cDNA模板，1 μL;Ex Taq（5 U·μL-1），0.3 μL，加ddH2O至25 μL。按照如下扩增程序进行：94℃预变性5 min;循环35个（94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s）;72℃ 8 min。PCR产物经胶回收纯化后连接到pUCm T载体上，用通用引物M13进行菌液PCR检测，筛选正确的阳性克隆子送深圳华大基因生物有限公司测序。

1.2.3 果实发育过程中EjNAD MDH基因的表达分析 以转录组中的Actin为内参基因，分别设计内参基因和目的基因荧光定量引物为Actin F和Actin R、QMDH F和QMDH R（表1），使用植物多糖多酚RNA提取试剂盒提取枇杷果实不同成熟期的RNA， 参照PrimeScriptTM RT reagent kit（Perfect Real Time）试剂盒的方法合成cDNA。实时定量 PCR 体系按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ试剂盒说明书进行，反应参数为95℃30 s，1个循环;95℃5 s，60℃20 s，45个循环，每个样品设3次生物重复和3次技术重复。以actin为内参基因，对枇杷在不同发育时期的表达量进行分析。

1.2.4 生物信息学分析 使用DNAMAN软件比对和拼接氨基酸序列;利用Pfam 26.0（http：//pfam.sanger.ac.uk）和NCBI中Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）程序进行蛋白保守域结构预测。利用PredictProtein在线软件（http：//www.predictprotein.org/）进行蛋白质二级结构预测;利用 SWISS MODEL在线软件（http：//swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质三维结构預测。

1.2.5 NAD MDH基因的植物表达载体构建 采用 In Fusion同源重组技术构建植物表达载体。利用snapgene软件在NAD MDH基因的引物5′端添加与载体同源15 bp且含有酶切位点的上下游引物，引物序列见表1。分别使用Xba I和Sca I限制性内切酶酶切pBI121质粒，按照酶切体系：pBI121质粒8 μL、Xba I 1 μL、Sca I 1 μL、10×buffer 2 μL、ddH2O 8 μL，混匀后37°酶切过夜，获得含有Xba I和Sca I酶切位点的pBI121线性质粒。使用质粒快速

提取试剂盒提取对1.2.2中的菌液进行质粒提取，以提取的质粒为模板，使用带有同源15 bp的引物对其进行扩增，PCR条件与程序同1.2.2，对目的基因片段进行胶回收。将带有同源15 bp的NAD MDH基因片段与载体线性片段进行连接体系：线性PCR产物3 μL、线性载体1 μL、5X In Fusion HD Enzyme Premix 2 μL、ddH2O 4 μL。取2.5 μL的反应液转化到DH5α感受态细胞，并涂布在含有Kanna的LB板，37℃过夜培养，挑去单菌落进行PCR并送华大基因生物有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 枇杷果肉总RNA的提取

枇杷果肉总RNA经1%的琼脂糖电泳检验其完整性，结果如图1。从图1可以看出，RNA条带完整，18S和28S主条带清晰，且无DNA的污染，表明提取的总RNA质量良好，可用于后续反转录合成质量较好的cDNA。

2.2 枇杷NAD MDH基因的ORF克隆

以枇杷果实中的RNA为模板，设计1对引物MDH F和MDH R为上下游引物进行PCR扩增，获得了与预期片段大小一致约996 bp条带（图2），将PCR产物回收并进行连接转化，挑取白色菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的3个克隆子送华大基因生物有限公司测序，测序结果表明克隆的EjNAD MDH基因ORF为996 bp，编码332个氨基酸（图3），利用NCBI中Blast对序列进行同源检索，表明此序列与其他已登陆的苹果、李、梨的NAD MDH基因同源性高达95%～100%，将该基

2.3 EjNAD MDH基因编码的蛋白质的生物信息

利用ProtParam程序（https：//web.expasy.org/protparam/）翻译所得NAD MDH基因序列，得到的结果为NAD MDH基因共编码332个氨基酸残基，理论上的蛋白分子量35.61 kD，理论等电点为6.01，分子式为C1573H2533N433O478S14。其中，负电荷残基数为36个，正电荷残基数为32个，枇杷NAD MDH蛋白的不稳定系数为33.08（<40），属于稳定蛋白。EjNAD MDH基因编码蛋白的疏水性分析结果表明，疏水性最大值为1.800，最小值为-2.891，其大部分区域为亲水区（图4A）。采用NCBI数据库BLAST对编码蛋白结构域进行预测，得出MDH基因与其家族基因具有很高的特征序列（图4B），对于MDH蛋白进行二级结构预测时采用了SOPMA程序，其结果表明NAD MDH基因主要由α螺旋、β转角、延伸链、无规则卷曲四者组成，所占比例分别为45.18%、4.52%、16.87%和33.43%（图4C）。采用swissmodel对NAD MDH蛋白的三级结构进行预测，表明与4mdhB模型相似度高达80%（图4D）。

2.4 EjNAD MDH蛋白质的氨基酸同源性及系统发育分析

将NAD MDH基因编码的氨基酸提交到NCBI中的blast与蔷薇科植物的NAD MDH基因编码的蛋白质进行比对分析（图5），结果表明枇杷NAD MDH蛋白与蔷薇科的植物苹果、欧李、白梨等的同源性高达80%以上。在同源性的基础上运用MEGA 7软件构建系统进化树（图6），可以看出枇杷与苹果、白梨、欧李、甜樱桃等亲缘关系较近，但与番茄和胡杨关系较远。

2.5 NAD MDH基因植物表达载体的构建

分别使用Xba I和Sca I限制性内切酶酶切检测正确的质粒PBI121，产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳后表明酶切成功（图7），回收PBI121的线性片段，按照In Fusion试剂盒的操作说明将质粒的线性片段与带有同源15 bp的目的基因进行基因重组，对转化后的菌液进行PCR检验，与预期结果一致，得到996 bp的片段（图8），送华大基因生物有限公司进行检测，结果序列正确，表明载体EjNAD MDH  PBI121构建成功。

2.6 NAD MDH基因的定量表达分析

利用荧光定量对枇杷果实生长发育过程中的NAD MDH基因进行定量分析，由图9可知，解放钟和白梨果实中NAD MDH基因表达量有着相似的趋势，均呈现先升高降低再升高降低的趋势。解放钟NAD MDH基因的表达量较白梨的波动趋势大，两者都呈现锯齿状波动。在盛花期后95 d NAD MDH基因在两个枇杷品种中的表达量最高，分别为7.14和3.82;在花后80 d之后解放钟NAD MDH的表达量明显高于白梨的表达量。

3 讨论

植物细胞中含有多种类型的苹果酸合成酶如NAD MDH和NADP MDH等，其中NAD MDH主要参与三羧酸循环，是苹果酸代谢过程中合成苹果酸的关键酶之一[9]。近年来，前人对蔷薇科果树的MDH基因进行了广泛的研究。Yao等[10]从苹果果实克隆了cyMDH基因的全长，其保守序列996 bp，编码了332个氨基酸，并且通过转基因技术验证了MdMDH与苹果酸的合成有着密切的联系。田丽[11]从郁李的果实中分离克隆出NAD MDH基因的保守序列872 bp，与苹果、桃的MDH基因相似性为98%和95%。本研究從枇杷果实转录组数据中筛选出EjNAD MDH家族中表达量较高的EjNAD MDH基因，运用RT PCR技术克隆EjNAD MDH基因的保守区序列长度为996 bp，编码了332个氨基酸，蛋白分子量为35.61 kD，理论等电点为6.01，分子式为C1573H2533N433O478S14。EjNAD MDH蛋白属于亲水性蛋白。通过进化树分析，EjNAD MDH基因与其他物种的同源性很高，表明EjNAD MDH基因在进化上具有高度的保守性[12]。

利用荧光定量PCR对2个枇杷果实的NAD MDH基因在发育阶段的表达进行检测，采用Livak等[13]的2-ΔΔCT的方法对结果进行分析，结果表明高酸和低酸枇杷品种的NAD MDH基因表达量具有相似的波动趋势，两个品种在花后（即果实成熟前）50～80 d时NAD MDH基因的表达量很低，花后95 d（即果实成熟时）两个品种的基因表达量达到最高，果实成熟后表达量降低但波动趋势小。高酸（解放钟）枇杷的NAD MDH基因在果实发育过程中的表达量与低酸（白梨）枇杷的表达量存在显著差异，表明NAD MDH基因在两个品种酸度差异中起到重要的调控作用。

将分离克隆的目的基因转化到宿主基因组中，是基因工程的一项基本技术。植物表达载体是将目的基因转化宿主细胞的重要媒介，载体构建是通过遗传转化方法开展基因功能鉴定的重要环节[14]。分析不同载体构建的方法，表明现在的主流构建载体的方式是Gateway技术，预测未来载体构建的发展趋势将是无酶连接[15-19]。韩凯等[19]对传统的构建方法、Gateway和采用无缝克隆构建载体的技术进行分析，从操作步骤、成本和时间等多方面进行综合比较，表明采用无缝克隆技术构建的方法具有更高的优势。本研究使用无缝克隆技术[20]，成功构建了EjNAD MDH PBI121表达载体，并采用冻溶法将表达载体转化到农杆菌EHA105中。下一步将携带EjNAD MDH PBI121的农杆菌转入番茄等作物，为进一步研究EjNAD MDH基因的功能奠定基础。

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（責任编辑：林玲娜）