LRG1通过抑制p38/MAPK通路的活化缓解Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤

康 涛， 韩 征， 薛延莉， 杨 谦

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是全世界老年人痴呆的主要原因。尽管用于AD预防和治疗药物的研究很多，但该病目前还没有有效的治疗方法，在个人、医学和社会经济水平上造成越来越大的负担[1]。富亮氨酸α2糖蛋白1(Leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1,LRG1)是富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeat,LRR)蛋白家族中高度保守的成员，参与蛋白间相互作用、信号转导、细胞粘附、细胞存活、细胞凋亡和细胞转移等[2,3]。LRG1与各种类型的癌症、早期中性粒细胞分化、炎性疾病、心衰以及免疫疾病有关[4]。此外，有证据表明LRG1与神经退行性疾病[5]以及特发性正常脑积水[6]有关。Jin等研究发现LRG1加重小鼠脑缺血诱导的损伤[7]。在之前的研究报道LRG1在AD中高表达[8]，并且Se-Met作用于小鼠AD模型可以诱导LRG1表达水平下降[9]。然而，LRG1在AD发展中的具体作用仍是未知的。因此，本研究旨在探讨LRG1对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用，以期为AD的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Aβ1-42(美国Sigma公司)，人骨髓神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y，美国ATCC)，胎牛血清和DEME(美国Gibco公司)，Lipofectamine 2000 转染试剂盒(美国赛默飞世尔科技公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，CCK-8(日本Dojindo Molecular Technologies公司)，RNA逆转录试剂盒、cDNA合成试剂盒和qPCR定量试剂盒(日本Takara公司)，qPCR引物(上海生工公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Scientific公司)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Pall Corporation公司)，抗LRG1抗体、抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗p-p38抗体和抗p38抗体(美国Millipore公司)，抗NADPH抗体(美国Sigma公司)，辣根过氧化物酶(HRP)二抗(南京钟鼎生物公司)，Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(南京凯基生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞培养于添加了10%热灭活胎牛血清和0.1%青霉素/链霉素的DMEM培养，将细胞置于37 ℃含5% CO2的培养箱中。

1.2.2 实验分组 (1)使用不同浓度的Aβ1-42(3、6、9、12和15 μmol)处理SH-SY5Y细胞48 h。通过CCK-8实验检测细胞活性，Western blot实验检测LRG1蛋白表达。(2)SH-SY5Y细胞分为未处理组、Aβ1-42组、Aβ1-42+shRNA组、Aβ1-42+shLRG1组。培养48 h后，通过RT-qPCR检测LRG1 mRNA表达，CCK-8实验检测细胞活性，流式细胞术检测凋亡率，Western blot实验检测凋亡相关蛋白和p-p38的表达情况。(3)SH-SY5Y细胞分为未处理组、Aβ1-42组、Aβ1-42+shLRG1组、Aβ1-42+shLRG1+U-46619组。培养48 h后，通过CCK-8实验检测细胞活性，流式细胞术检测凋亡率。

1.2.3 细胞活性检测 将SH-SY5Y细胞接种于96孔板，每孔细胞数为1×104，待SH-SY5Y细胞长至85%融合后，分别用(3、6、9、12和15 μmol )Aβ1-42处理SH-SY5Y细胞48 h，不做任何处理的细胞作为空白对照。处理完成后，使用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测。

1.2.4 转染干扰质粒 将SH-SY5Y细胞接种于96孔板，每孔细胞数为1×104。待细胞进入对数生长期后，按照Lipo2000转染试剂说明书进行shLRG1和shRNA转染。以LRG1 mRNA为靶点的慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)合成于上海吉码公司。序列如下：sense 5’-AGC TAA AAA GAT GTT TTC CCA GAA TGA CTC TCT TGA AGT CAT TCT GGG AAA ACA TCG GG-3’;antisense 5’-AGC TAA AAA TTC TCC GAA CGT GTC ACG TTC TCT TGA AAC GTG ACA CGT TCG GAG AAG GG-3’。

1.2.5 RT-qPCR 未处理组、Aβ1-42、Aβ1-42+shRNA、Aβ1-42+shLRG1细胞均匀接种于96孔板，37 ℃条件下培养48 h。收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，取2 μg总RNA进行反转录实验,并根据qPCR试剂盒说明书进行SH-SY5Y细胞LRG1转录水平检测。GAPDH作为内参基因。LRG1定量序列如下：sense 5’-TACAGCACCTGGATATGTTGGA-3’；antisense 5’-GTTGTGGGAGATGTCG-3’。2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，每个样本设置3个重复。

1.2.6 Western blot 未处理组、Aβ1-42、Aβ1-42+shRNA、Aβ1-42+shLRG1细胞均匀接种于96孔板，37 ℃条件下培养48 h。收集并裂解细胞，BCA法检测蛋白的总浓度，10%～12% SDS-PAGE凝胶分离蛋白并转移到PVDF膜上，室温封闭3 h。用LRG1(1∶100)、Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶500)、p-p38(1∶1000)、p38(1∶1000)和NADPH(1∶2000)的初抗4 ℃孵育过夜。随后，室温下用HRP二抗(1∶5000)孵育1 h。实验重复3次。

1.2.7 细胞凋亡检测 未处理组、Aβ1-42、Aβ1-42+shRNA、Aβ1-42+shLRG1细胞均匀接种于96孔板，37 ℃条件下培养48 h。使用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测各组细胞的凋亡情况。

2 结 果

2.1 LRG1在Aβ1-42处理的SH-SY5Y中表达量上调 本研究将SH-SY5Y与Aβ1-42孵育模拟AD的细胞模型。不同浓度的Aβ1-42(3、6、9、12和15 μmol)处理SH-SY5Y细胞48 h后通过CCK-8实验检测细胞活性。CCK-8实验结果表明，与未处理组相比，随着Aβ1-42的浓度的增加，细胞的活性不断被抑制(P<0.05，见图1A)。另外，Western blot实验结果表明，Aβ1-42处理SH-SY5Y细胞48 h后LRG1蛋白表达水平显著升高且与Aβ1-42处理浓度有关(P<0.05，见图1B)。本实验选取12 μmol作为Aβ1-42体外诱导SH-SY5Y损伤的浓度。

2.2 LRG1沉默缓解Aβ1-42诱导的细胞凋亡 为了探究LRG1对Aβ1-42诱导的细胞损伤的作用，本研究使用LRG1干扰质粒转染SH-SY5Y细胞。将SH-SY5Y细胞分为以下4组：未处理组、Aβ1-42组、Aβ1-42+shRNA组、Aβ1-42+shLRG1组，培养48 h。通过RT-qPCR检测实验LRG1转录水平。RT-qPCR结果表明，LRG1沉默显著抑制Aβ1-42诱导的LRG1转录水平(P<0.05，见图2A)。相似地，使用CKK-8、流式细胞术和Western blot分别检测细胞活性、凋亡率和凋亡相关蛋白水平。实验结果发现Aβ1-42处理SH-SY5Y细胞显著降低细胞活性、提高细胞凋亡率、抑制Bcl-2蛋白水平以及促进Bax蛋白表达；然而LRG1沉默缓解了由Aβ1-42引起的细胞活性的降低、细胞凋亡率的升高、Bcl-2蛋白水平的下调以及Bax蛋白表达的上调(P<0.05，见图2B～D)。

2.3 LRG1沉默调节p38/MAPK信号通路 为了探究LRG1敲除缓解Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤的可能机制，我们进一步研究了p38/MAPK信号通路。将SH-SY5Y细胞分为以下4组：未处理组、Aβ1-42组、Aβ1-42+shRNA组、Aβ1-42+shLRG1组，培养48 h。通过Western blot检测实验p38磷酸化水平。Western blot结果表明，Aβ1-42诱导p38磷酸化水平上调，然而，LRG1沉默抑制Aβ1-42诱导的p38磷酸化水平上调(P<0.05，见图3A)。因此，LRG1沉默可能抑制Aβ1-42诱导的p38/MAPK信号通路的激活。

2.4 p38/MAPK信号通路的激活减弱LRG1沉默对Aβ1-42诱导细胞损伤的保护作用 随后，我们检测了p38/MAPK信号通路和LRG1在Aβ1-42诱导细胞损伤中的关系。将SH-SY5Y细胞分为以下4组：未处理组、Aβ1-42组、Aβ1-42+shLRG1组、Aβ1-42+shLRG1+U-46619组，培养48 h。通过CCK-8和Western blot检测细胞活性和凋亡率。结果表明，沉默LRG1缓解了由Aβ1-42引起的细胞活性的降低和细胞凋亡率的升高。然而，U-46619(p38信号通路的特异性激活剂)处理显著抑制了LRG1沉默对Aβ1-42诱导细胞损伤的保护作用(P<0.05，见图4A、B)。这些结果表明了LRG1沉默保护Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤是通过抑制p38/MAPK信号通路的激活。

图1 Aβ1-42对SH-SY5Y细胞活性和LRG1表达的影响与对照组比较*P<0.05

3 讨 论

本实验探究了LRG1在Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用和潜在机制。在这里，我们发现Aβ1-42处理可有效地抑制SH-SY5Y细胞活性。此外，Aβ1-42可上调LRG1的表达量，且其表达量的变化与Aβ1-42处理的浓度有关。与本研究结果类似，先前的研究也表明在七氟醚诱导AD小鼠中LRG1水平显著上调[10]，并且Zou等的报道同样指出LRG1在AD患者中的基因水平显著高于正常人[8]。研究表明，在心机梗死的小鼠中沉默LRG1促进成纤维细胞的增殖能力[11]。Jin等的研究表明在小鼠急性缺血性脑卒中LRG1过表达显著促进神经元细胞的凋亡[7]。同样的，本研究也发现沉默LRG1可有效缓解Aβ1-42诱导的神经细胞活性降低和细胞凋亡增加。细胞凋亡是神经退行性疾病和神经系统疾病的重要原因，如帕金森病和AD[12]。而研究已经证明Aβ积累诱导的神经细胞凋亡在AD发病机制中起着举足轻重的作用[13]。最近的研究表明在小鼠急性缺血性脑卒中LRG1过表达显著促进神经元细胞的凋亡和自噬[7]。本研究的结果表明，Aβ1-42处理可以显著降低SH-SY5Y细胞活性，促进细胞凋亡，而沉默LRG1逆转了Aβ1-42的作用。这些结果表明LRG1沉默可以缓解Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)在细胞外刺激转化为一系列胞内磷酸化级联过程中起着重要的转导作用[14]。研究表明MAPKs调节Aβ1-42诱导AD神经炎症反应、神经元死亡和认知缺失[15]。p38信号途径作为MAPKs中一种，优先被炎症细胞因子和细胞外压力(如紫外线、热量和活性氧)激活[16]。在早期AD患者的脑部可以发现p38/MAPK信号的激活，而减弱p38/MAPK信号可以减少Aβ1-42诱导神经元死亡[17]。Ban等研究表明在甲状腺癌细胞中过表达LRG1显著增加p38的磷酸化水平[18]。另外，Xie等的结果也证明了LRG1与表皮生长因子受体相互作用进一步激活了p38/MAPK信号通路[19]。本研究结果表明，沉默LRG1可以抑制Aβ1-42诱导的p38的磷酸化和细胞凋亡，并且p38/MAPK信号通路的特异性激活剂U-46619可以逆转保护效果。这些结果表明LRG1沉默可以抑制p38/MAPK信号通路的激活从而缓解Aβ1-42诱导的细胞损伤。

综上所述，LRG1沉默可以缓解Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤。其机制可能是LRG1沉默抑制p38/MAPK信号通路的激活。因此，LRG1可以作为一个潜在的分子靶点用于治疗老年痴呆。