实时直接分析-静电场轨道阱高分辨质谱法应用于化妆品中15种抗过敏药物的定性和定量分析

蓝 草，邵琳智，徐 娟

(广州海关技术中心，广州 510623)

随着社会经济的不断发展和人们生活水平的不断提高，化妆品已经成为人们日常生活的必需品和美化生活的时尚产品，因此，人们对化妆品的功效和质量提出了更高的要求[1-2]。抗组胺类药物是皮肤科常用的抗过敏药物，常应用于湿疹、药疹、接触性皮炎及皮肤瘙痒症等发痒性皮肤病的治疗。长期使用含有抗组胺药物的化妆品会导致药物依赖性皮炎，只要停用，过敏症状就会加重，可能引起毛细血管扩张、萎缩，皮肤变薄、色素沉着、皮炎等症状或人体内激素水平变化造成的内分泌混乱、月经不调等不良反应[3-4]。因此，我国《化妆品卫生规范》[5]规定:地氯雷他定等15种抗过敏药物不得作为生产原料及组分添加到化妆品中。

目前，化妆品中抗过敏类药物的检测方法主要有高效液相色谱法[6-8]和液相色谱-质谱法[4，9-11]，但这些方法通常需要较长的分析时间，或具有较强的基质干扰、易造成仪器的污染等缺点。

实时直接分析法(DART)是较早实现商品化的一种常压敞开式离子化方法。这种分析方法无需色谱分离，具有直接、快速、不需样品预处理或只需简单预处理等特点，可在几秒内完成数据分析与采集，实现了高通量的样品检测和筛查分析，常被应用于食品药品非法添加及残留[12]、司法鉴定[13-14]、成分分析[15]等领域。DART 利用辉光放电产生的激发态氦或氮作为离子化试剂与待测物接触，通过彭宁离子化、质子转移以及电荷交换等过程使待测物离子化，然后采用质谱进行检测，从而实现样品的实时直接分析[16-17]。

静电场轨道阱高分辨质谱(Q Exactive-Orbitrap MS)技术在其扫描质量范围内可提供目标化合物的精确质量数，其灵敏度不及高端三重四极杆质谱的，但Q Exactive-Orbitrap MS具有质量分辨率高、数据库建立和检索方便、样品组织基质干扰少、操作便利性高、不需要设定时间窗口等优点，在定性筛查、定量分析中具有广泛的应用前景。

DART 离子源作为一种软电离技术，其与高分辨质谱的联用，能得到具有精确质量数的准分子离子峰和丰富的碎片离子。本工作采用实时直接分析-静电场轨道阱高分辨质谱法，研究建立了化妆品中15种抗过敏药物的快速筛查及确证方法。通过匹配自建谱库，筛查出非法添加的抗过敏药物，再进行确证定量。该方法无需复杂的样品前处理和耗时的色谱分离，大大减少了化学溶剂的使用量，大幅度缩短样品的分析周期，避免了样品基质的干扰，并且降低了对仪器的污染程度[18-19]，能够快速、准确地得到各种基质的化妆品中抗过敏药物含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Q-Exactive型静电轨道阱质谱仪；DART SVP型实时直接分析离子源；BT124S型分析天平；1-14型高速离心机；3-30K 型高速离心机；MS3 basic型漩涡振荡器；SW 30H 型超声波水浴。

单标准储备溶液:称取15种抗过敏药物标准品各10 mg，分别用甲醇溶解并定容至100.0 mL，配制成100 mg·L－1的标准储备溶液，于－20 ℃避光保存。使用时，用甲醇将其稀释至所需质量浓度，现配现用。

地氯雷他定、氯苯那敏、阿斯咪唑、曲吡那敏、溴苯那敏、苯海拉明、异丙嗪、羟嗪、奋乃静、西替利嗪、氟奋乃静、氯丙嗪、氯雷他定、特非那定、赛庚啶等15种标准品的纯度均不小于98.0%；乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇为高效液相色谱级；甲酸为专业分析级；其他试剂均为国产分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)DART 条件 正离子模式；离子化气体为高纯氦气(纯度为99.999%)，氦气的流量为3 L·min－1；气体离子化温度为500 ℃；进样模式为12 Dip-it Samplers，进样量为1μL，进样速率为0.3 mm·s－1；离子源出口距质谱进口约10 mm。

2)质谱条件(定性筛查) 正离子模式；一级全扫描-数据依赖性二级扫描模式(Full MS-dd MS2)；扫描范围m/z100～1 000；一级全扫描分辨率70 000；吹扫气流量7.00 mL·min－1；离子最大容纳数量1×106；离子最大注入时间100 ms；二级扫描分辨率17 500；离子最大容纳数量2×105；离子最大注入时间100 ms。

3)质谱条件(确证) 平行反应监测模式(PRM)；扫描分辨率17 500；离子最大容纳数量2×105；离子最大注入时间100 ms；母离子、子离子和归一化碰撞能量见表1，其中“∗”为定量离子对。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

称取0.50 g试样于15 mL离心管中，加入50%(体积分数，下同)乙醇溶液1.0 mL 置于超声波水浴中超声5 min，涡旋振荡10 min，以10 000 r·min－1的转速离心5 min，取上清液0.5 mL 至1.5 mL塑料离心管中，加入0.5 mL 水，涡旋混匀，以10 000 r·min－1的转速离心5 min，上清液按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

15种抗过敏药物均易得到质子，因此采用正离子模式进行分析。在采用Full MS-dd MS2扫描时，阶梯式的归一化碰撞能量可得到低、中、高等3种碰撞能量下的样品二级质谱的叠加图，能够得到较为丰富的碎片离子信息。试验考察了归一化碰撞能量分别为(20，40，60)，(20，40，80)，(20，40，100)和(10，40，100)时对15 种抗过敏药物二级质谱的影响。结果表明:在归一化碰撞能量为(10，40，100)时，15种抗过敏药物均能够得到较好的二级质谱信息。此二级质谱信息可用于定性筛查谱库的建立，同时得到的子离子信息可为目标物的测定做准备。

2.2 DART条件的优化

2.2.1 离子化温度

DART 离子源需要高温才能使激发态的惰性气体解析并瞬间离子化待测化合物，因此离子化温度是非常重要的参数，过高和过低的温度均会影响DART 的离子化效率和背景噪音，高温会加速待测样品的热解吸率，使更多的待测样品进入质谱检测器，增强目标物的响应。然而，过高的温度会导致待测样品在热解过程中被降解，灵敏度降低[14]。因此，试验考察了离子化温度分别为300，400，500 ℃时对15种抗过敏药物的响应情况的影响，结果见图1。

图1 不同离子化温度下的选择离子流图Fig.1 SIC chromatogram under various ionization temperatures

由图1 可以看出:离子化温度为500 ℃时，15种抗过敏药物的响应最高，试验选择的离子化温度为500 ℃。

2.2.2 样品传输速度

DART 软件能通过控制线性轨道上Dip-it玻璃棒的移动速度来控制待测样品在离子化区域的停留时间，进而影响着样品的峰形和响应强度。DART 软件推荐的样品传输速度为0.2～0.6 mm·s－1，因此，试验考察了样品传输速度分别为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mm·s－1时对15种抗过敏药物的峰形和离子响应强度的影响。结果表明，样品传输速度越快，峰形越尖锐；但当传输速度过快时，离子化气体与样品接触时间过短，导致离子化效率低，响应降低；样品传输速度过慢时，峰形较宽，响应也较低；样品传输速度为0.3，0.4，0.5 mm·s－1时，15种抗过敏药物的响应差别不大，但样品传输速度越慢，信号越稳定，扫描点数多，定量也更准确。因此，试验选择样品传输速度为0.3 mm·s－1。

2.2.3 提取溶剂

当分别采用甲醇、乙醇和乙腈对加标样品进行提取时，发现上述溶剂较易挥发和扩散，得到的响应较低且不稳定、峰形较差。由于3种有机溶剂中待测物响应值差别不大，试验选取毒性较小的乙醇和其他介质进行掺杂，以改善上述问题。试验考察了乙醇、50%乙醇溶液和体积比为1∶1的乙醇-异丙醇溶液对待测物响应值的影响，结果见图2。

图2 溶剂对分析物响应值的影响Fig.2 Effect of the solvent on the response of the analyte

由图2可知:稀释后的乙醇溶液响应更高，峰形也较纯溶剂的更尖锐，可能是因为稀释液的加入使提取液液滴更不容易挥发和扩散，离子化效率变好。综合考虑响应、峰形、毒性和成本等因素，试验选择50%乙醇溶液为提取溶剂。

2.3 15种抗过敏药物的定性分析

按照仪器工作条件，分别对15种抗过敏药物进行Full MS-dd MS2模式扫描，得到15种抗过敏药物的二级质谱图，见图3。采用mz Vault软件自建标准二级谱库，将二级质谱图导入到自建二级谱库进行分析，设置提取质量窗口的质量偏差为5×10－6，保留时间偏移0.5 min，最小响应50 000，软件匹配度不小于90%。

图3 15种抗过敏药物的二级质谱图Fig.3 MS2 spectra of the 15 anti-allergics

2.4 标准曲线和测定下限

在定性筛查后，又对筛查后的药物进行了测定。以样品为基质配制0，0.25，0.5，1.0，2.0，5.0，10 mg·L－1的混合标准溶液系列，放置30 min，使加入的标准溶液与样品充分混合。按照仪器工作条件进行测定，以15种药物的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，15种药物标准曲线的线性范围在10 mg·L－1以内，其线性回归方程、相关系数见表2。

在空白样品中添加15种抗过敏药物混合标准溶液，测得的信噪比远远大于10，按照《化妆品安全技术规范》中要求，把本方法的测定下限设为0.5 mg·kg－1。

表2 线性参数Tab.2 Linearity parameters

2.5 精密度和回收试验

在空白化妆品样品中进行3个浓度水平的加标回收试验，每一水平设6个平行样，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

由表3 可知:RSD 为6.3%～15%；回收率为82.3%～128%，方法的准确度和精密度满足定量分析的要求。

2.6 样品分析

按照试验方法对20个市售化妆品进行测定，其中，7个样品检出苯海拉明，1个样品检出氯苯那敏，检测结果和自建二级谱库匹配度均大于90%。同时，对本方法的测定结果和《化妆品安全技术规范》(2015 版)[5]中的液相色谱-串联质谱法(LCMS/MS)的进行了比对，发现两者结果一致，表明本方法有较好的准确度。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6) %

本方法采用DART-Q-Exative-orbitrap MS 建立了一种化妆品中15种抗过敏药物的快速筛查及定量分析方法。该方法样品简单、快速，且试验结果与LC-MS/MS[5]的一致，具有广阔的应用前景。