气相色谱-质谱联用法测定婴幼儿奶粉中37种脂肪酸和12种反式脂肪酸

田春霞，王远远，吴苏妙，朱炳祺，金绍强∗

(1.浙江省疾病预防控制中心，杭州 310051；2.浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052；3.杭州汉库医学检验所有限公司，杭州 310051)

婴幼儿是具有特殊营养需求的一类群体，由于其自身代谢系统尚未完善，营养的摄入要求全面均衡[1]。婴幼儿配方奶粉的主要原料为生牛乳及精炼植物油等，其中的脂肪高达25%～31%，包括脂肪酸和极少量的反式脂肪酸(TFAs)两类，脂肪酸包括饱和脂肪酸(SFAs)和不饱和脂肪酸(UFAs)，后者又可分为单不饱和脂肪酸(MUFAs)和多不饱和脂肪酸(PUFAs)。植物油在加工和使用过程中很容易发生氢化产生TFAs，而企业现有的工艺、设备及其使用的标准均无法有效地控制婴儿奶粉中的TFAs含量，潜在质量安全风险较高[2]，这给食用奶粉的婴儿带来了负面的健康影响[3]。有研究表明，长期食用含有TFAs的奶粉，不仅会干扰婴幼儿对必需脂肪酸的吸收，还会造成婴幼儿中枢神经系统发育障碍[4-5]。因此，国际食品法典委员会(CAC)对婴幼儿配方食品中的TFAs含量的限定规定为不超过总脂肪酸的3%(质量分数)；从2010年起，中国对婴儿配方食品也作出了同样的规定[1，3，6]。

目前关于食品中脂肪酸和TFAs的检测方法有很多，主要包括光谱法、色谱法及银离子薄层色谱法等[7]。光谱法包括红外光谱法(近红外、中红外光谱)和拉曼光谱法，光谱法检测反式脂肪酸简便快速，对样品无损伤，但只能获得TFAs的总含量，无法获得单个TFA 的含量[8-12]，且TFAs在脂肪中的含量远低于脂肪酸，在检测时易受脂肪酸的干扰。色谱法包括液相色谱法[13-15]和气相色谱法[16-18]。液相色谱法一般需要先采用衍生试剂对样品进行前处理，然后再利用荧光或者紫外检测器进行检测，该方法响应灵敏度不高，存在一定的应用局限性[19]。气相色谱法灵敏度高，测定结果稳定，已被国家标准GB 5009.168－2016 和GB 5009.257－2016 采用。然而，婴幼儿奶粉中脂肪酸组成复杂，且标准品有限，国家标准选用的气相色谱法仅靠保留时间定性，很难通过色谱分离和质谱定性对一些未知色谱峰进行判断。气相色谱-质谱法(GC-MS)可实现复杂混合物的定性定量分析，其在反式脂肪酸检测上的应用开始被越来越多的人所关注[20]。

由于脂肪酸和反式脂肪酸的检测原理一致，本工作基于将脂肪酸先转化为沸点较低且易于气化的脂肪酸甲酯，根据其在极性毛细管色谱柱的保留规律建立了GC-MS 测定婴幼儿奶粉中脂肪酸及TFAs含量的方法，以期为婴幼儿奶粉中脂肪酸和TFAs的测定方法做出有益探索。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B-7000C 型气相色谱-质谱联用仪，配7693自动进样器；Multifuge型台式高速冷冻离心机；RV 10 型旋转蒸发仪及真空泵；METER XPE 205型电子天平；SW 23型恒温振荡水浴箱。

12 种反式脂肪酸甲酯混合标准储备溶液:5.00 g·L－1，分别称取反式脂肪酸甲酯标准品各100.0 mg，用异辛烷溶解并定容至10.0 mL，在(－18±4)℃下保存。

37种脂肪酸甲酯混合标准储备溶液:10 g·L－1，介质为异辛烷。

反式脂肪酸甲酯混合标准溶液中间液:0.2 g·L－1，吸取反式脂肪酸甲酯标准储备溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，用异辛烷定容，在(－18±4)℃下保存。

脂肪酸甲酯混合标准溶液中间液:0.5 g·L－1，吸取37种脂肪酸甲酯混合标准储备溶液1 mL 于20 mL容量瓶中，用异辛烷定容，在(－18±4)℃下保存。

2 mol·L－1氢氧化钾-甲醇溶液:取13.1 g氢氧化钾溶解在100 mL甲醇中，可轻微加热，加入无水硫酸钠干燥，过滤，得到澄清溶液。

60 g·L－1碳酸钠溶液:称取6 g无水碳酸钠，用水溶解并定容至100.0 mL。

反-9-十六碳烯酸甲酯(C16:1 9t)、反-6-十八碳烯酸甲酯(C18:1 6t)、反-9-十八碳烯酸甲酯(C18:1 9t)、反-11-十八碳烯酸甲酯(C18:1 11t)、反亚油酸甲酯(C18:2 9t，12t)、反-10-顺-12-十八碳二烯酸甲酯(C18:2 10t，12c)、反-13-二十二碳烯酸甲酯(C22:1 13t)、反-11-二十碳烯酸甲酯(C20:1 11t)等8种反式脂肪酸甲酯标准品纯度均大于99%；4种亚麻酸甲酯顺反异构体(反式脂肪酸甲酯)混合标准品的质量浓度为10 g·L－1[其种类和含量比例为:C18:3 9t，12t，15t(30%)；C18:3 9t，12t，15c＋C18:3 9t，12c，15t＋C18:3 9c，12t，15t(45%)；C18:3 9c，12c，15t＋C18:3 9c，12t，15c＋C18:3 9t，12c，15c(21%)，C18:3 9c，12c，15c(4%)]；3种不同品牌配方奶粉均购自超市；95%乙醇、盐酸、氨水、乙醚、石油醚、异辛烷、甲醇、氢氧化钾、硫酸氢钠、正己烷、乙酰氯、无水碳酸钠等试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 HP-88毛细管色谱柱(100 m×0.25 mm，0.25μm)；进样口温度250 ℃；溶剂延迟11.5 min；载气为高纯氦气(纯度不小于99.999%)；分流比10∶1；流量1 mL·min－1；进样量1.0μL。色谱柱升温程序:初始温度为130 ℃，保持5 min；然后以2 ℃·min－1的速率升温至220 ℃，保持8 min；再以2 ℃·min－1速率升温至240 ℃，保持10 min。

2)质谱条件 电子轰击(EI)离子源；电子能量70 e V；离子源温度230℃；接口温度220℃；全扫描范围m/z45～450。

1.3 试验方法

称取5.0 g 奶粉置于锥形瓶中，加入乙醇2 mL和水4 mL，混匀，再加入氨水20 mL，混匀，放在75 ℃的恒温振荡水浴中水解40 min。每5 min振荡锥形瓶，将黏在瓶壁的颗粒物混入溶液中。水解完成后，取出锥形瓶冷却至室温，加入乙醇10 mL，混匀后转移至离心管中，用体积比为1∶1的乙醚-石油醚混合液30 mL 冲洗锥形瓶，冲洗液也倒入离心管中，加盖。在低温摇床中振摇10 min，然后以5 000 r·min－1转速离心5 min，上清液收集至100 mL烧瓶中。按照以上步骤重复提取2次，合并醚层提取液并用旋转浓缩至干，残留物为脂肪提取物。称取脂肪提取物样品60.0 mg至离心管中，加入异辛烷4 mL溶解样品，再加入2 mol·L－1氢氧化钾-甲醇溶液200μL，加盖后振摇30 s后静置至澄清。加入约1 g硫酸氢钠中和氢氧化钾，以3 000 r·min－1的转速离心3 min，将上清液移至进样瓶中，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱

由于婴幼儿配方奶粉中的乳脂、植物油、鱼油、藻油等均为脂肪来源，脂肪酸构成复杂，因此需要采用高极性色谱柱进行分离。本工作考察了SP-2560和HP-88毛细管色谱柱的分离效果，当采用SP-2560毛细管色谱时，顺-13-二十二碳烯酸甲酯(C22:1n9)和顺-11，14，17-二十碳三烯酸甲酯(C20:3n3)不能分离，只出现一个峰。采用HP-88毛细管色谱柱，结果显示以上两种物质达到基线分离且峰形良好。因此，试验选用HP-88毛细管色谱柱。

2.1.2 色谱柱升温程序

升温程序会对脂肪酸的分离产生影响。试验考察了两种不同的升温程序:①试验方法中升温程序；②初始温度为130 ℃，保持5 min；以1 ℃·min－1速率升温至220 ℃，保持8 min；以1 ℃·min－1速率升温至240 ℃，保持10 min。试验发现，当采用第二种方法进行分离时，因升温速率过慢，目标物出峰时间延长，峰宽变大，峰形变差。试验选择试验方法中的升温程序。

按照优化后的色谱条件对脂肪酸和反式脂肪酸进行测定，由于检测反式脂肪酸时，很容易受脂肪酸的干扰，因此对12种反式脂肪酸甲酯混合标准溶液和37种脂肪酸甲酯混合标准溶液分别进样，有利于对样品进行比较和检索，色谱图见图1。在实际分析中，由于奶粉中脂肪酸种类较少，对奶粉中的脂肪酸和TFAs进行同时测定时，即使部分谱峰发生重合，也可通过定性离子和质谱库检索进行区分。

由图1可知:大部分脂肪酸甲酯的分离效果都很好；只有部分反式脂肪酸甲酯，如C18:3 9t，12t，15c和C18:3 9t，12c，15t、C18:3 9c，12t，15t 和C18:3 9c，12c，15t、C18:3 9c，12t，15c和C18:3 9t，12c，15c的分离效果不够理想，但可满足日常检测的要求。

2.2 脂肪提取方法的选择

试验分别考察了采用酸水解法、碱水解法、酸碱水解法对脂肪提取率的影响。酸水解法、碱水解法和酸碱水解法脂肪的提取率分别为16.89%，19.14%，15.21%，碱水解法的提取率较高，和GB 5009.168－2016中的脂肪提取方法一致。因此，试验采用碱水解法。

2.3 甲酯化方法的选择

本工作分别采用氢氧化钾-甲醇法和乙酰氯-甲醇甲酯化法对奶粉进行试验，结果见表1和表2。

由表1和表2 可知:这两种方法测得的SFAs含量相似；乙酰氯-甲醇甲酯化法测得的PUFAs含量是氢氧化钾-甲醇法的2.0倍；氢氧化钾-甲醇法测得的UFAs 的含量是乙酰氯-甲醇甲酯化法的1.5倍；氢氧化钾-甲醇法测得的TFAs总含量与乙酰氯-甲醇甲酯化法相近，但氢氧化钾-甲醇法测得的TFAs种类更多，能提供更多的信息，综合考虑，试验选用氢氧化钾-甲醇法作为甲酯化方法。

2.4 定量方法和检出限

奶粉中脂肪酸含量的定量方法有外标法、内标法和面积归一化法。对于同系物含量的测定，面积归一化法更简便。因此，采用面积归一化法测定脂肪酸的含量。

由于TFAs含量比较低，仪器灵敏度不够，极易被脂肪酸掩盖，本工作对TFAs进行了外标法验证。以正己烷将反式脂肪酸甲酯混合标准溶液中间液逐级稀释成5，10，20，50，100，200 mg·L－1混合标准溶液系列，然后在仪器工作条件下进行测定。以12种反式脂肪酸甲酯的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性范围、线性回归方程和相关系数见表3。

以3倍信噪比计算反式脂肪酸甲酯的检出限(3S/N)，结果见表3。

2.5 精密度及回收试验

在婴幼儿奶粉样品中加入C16:1 9t、C18:2 9t，12t、C22:1 13t标准溶液进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验(n＝5)，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，见表4。

由表4 可知:3 种物质的回收率为75.5%～107%，RSD 为1.1%～8.5%，方法准确可靠，基本能满足实际测定需要。

2.6 样品分析

根据试验方法对3种市售婴幼儿奶粉(分别标记为奶粉-1、奶粉-2、奶粉-3)进行测定，不同脂肪酸和TFAs测定结果见表5。

图1 脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solutions of fatty acid methyl ester and trans-fatty acid methyl ester

表1 不同甲酯化方法测得的奶粉中的脂肪酸甲酯含量Tab.1 Content of fatty acid methyl ester in milk powder determined by the different methylation methods

表1 (续)

表2 不同甲酯化方法测得的奶粉中的反式脂肪酸甲酯含量Tab.2 Content of trans-fatty acid methyl esters in milk powder determined by the different methylation methods

由表5 可知:奶粉中SFAs 的含量最高，为53.9%～58.3%；TFAs的含量均小于0.5%，小于国家标准规定的最高含量(3%)；有两种奶粉中并未检出芥酸(对应C22:1)，另一种奶粉检测出的芥酸含量小于国家标准规定的1%。3 种奶粉中，月桂酸(对应C12:1)和肉豆蔻酸(对应C14:0)含量最高为15.81%，最低为13.03%，均小于国家 标准规定(20%)。3 种奶粉中所测得的花生四烯酸(对应C20:4)含量最高为0.31%，二十二碳六烯酸(对应C22:6n3)含量最高为0.23%，均符合国家标准。

表3 反式脂肪酸甲酯的线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限(n＝6)Tab.3 Linear ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits of trans-fatty acid methyl esters(n＝6)

表4 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

表5 3种奶粉中脂肪酸和TFAs的含量Tab.5 Content of the fatty acids and TFAs in the 3 milk powders

本工作建立的方法简单快捷，可以满足奶粉中脂肪酸和TFAs的日常检测，为奶粉中脂肪酸的营养安全研究工作提供支持，同时对其他样品中脂肪酸和TFAs的同时检测提供参考。