2019年辽宁省兽医系统实验室检测能力比对结果分析

（辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110164）

自农业农村部2010年实施全国兽医系统实验室考核制度以来，实验室比对作为检验和提升各级兽医系统实验室检测能力的重要手段，在全国各级兽医系统实验室范围内被广泛采用[1-3]，在加强和促进全国各级兽医系统实验室管理体系建立与持续改进、实验室规范化管理水平和检测能力持续提升等方面发挥了重要作用。

2019年10 月，辽宁省农业发展服务中心动物疫病预防控制中心（以下称辽宁省疫控中心）组织开展了全省市、县级兽医系统实验室检测能力比对。全省14个地市级、24个生猪调出大县（具备分子生物学检测能力）和33个其他县级（仅具备血清学检测能力）兽医系统实验室参加了比对，并在规定时限内完成比对项目。本次能力比对是在经历2018年辽宁省机构改革，全省各级疫控机构发生重大变革、人员发生较大变动的情况下组织实施，较为客观地反映了当前辽宁省市、县级兽医实验室的检测能力水平，为下一步各级政府兽医主管部门制定针对性政策措施，推进全省兽医系统实验室整体检测能力的提升提供了科学依据。

1 材料和方法

1.1 比对项目设置

根据地市、县级兽医实验室具备分子生物学检测能力和血清学检测能力的不同，14个地市级及24个生猪调出大县兽医实验室参加非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸荧光PCR、H7 亚型禽流感病毒（AIV）抗体HI 试验和猪O 型口蹄疫病毒（FMDV）抗体阻断ELISA 等3个比对项目；33个其他县级兽医实验室参加H7 亚型AIV 抗体HI 试验、猪O型FMDV 抗体阻断ELISA 和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体间接ELISA 等3个比对项目。

1.2 比对方法、检测试剂和标准

针对不同的比对项目，依据相应的国家标准、农业农村部公布或推荐的检测方法，各项目使用的检测试剂盒及参考标准样品由辽宁省疫控中心提供，保证每种试剂和标准样品为同一批次，并通过辽宁省疫控中心验证符合要求（表1）。

1.3 比对样品

比对项目的参考标准样品由相应项目的国家参考实验室、试剂公司提供，经辽宁省疫控中心再次验证后，完成各比对项目的盲样制备、标定、分装、编号、保存和发放。

1.3.1 ASFV 核酸荧光PCR 比对样品 参考标准阳性、阴性核酸样品进行不同倍数稀释，重新进行定值后制备成盲样，阴、阳性样品进行随机组合成一组6 份盲样。

1.3.2 H7 亚型AIV 抗体HI 试验比对样品 参考值为0log2、6log2、8log2 和10log2 的禽血清样品，随机组合成一组6 份盲样，各参考值样品数量不确定。

1.3.3 猪O 型FMDV 抗体阻断ELISA 比对样品 参考值为1:720、1:360、1:90 和＜1:8 的猪血清样品，随机组合成一组6 份盲样，各参考值样品数量不确定。

1.3.4 PRRSV 抗体间接ELISA 比对样品 参考值为阳性、弱阳性和阴性的猪血清样品，随机组合成一组6 份盲样，阴性、弱阳性、阳性样品数量不确定。

1.4 样品的传递

由14个地市级兽医实验室派专人统一到辽宁省疫控中心领取市本级和所辖县区实验室的比对盲样及检测试剂，全程冷藏运送，并于当日送达各参加比对的实验室。各实验室须在规定的时限内完成比对检测工作，并规范上报比对结果。

表1 比对项目的检测方法、依据标准和主要试剂

1.5 结果判定标准

ASFV 核酸荧光PCR 和PRRSV 抗体间接ELISA 比对项目的判定标准：盲样的检测结果与标定值完全一致，即参考值为阳性（含弱阳性）的盲样检测结果为“阳性”，参考值为阴性的盲样检测结果为“阴性”，判为比对结果正确，否则为错误；H7 亚型AIV 抗体HI 试验和猪O 型FMDV 抗体阻断ELISA 比对项目的判定标准：盲样的检测结果偏离在1个滴度范围内，判为比对结果正确，如存在2个及以上滴度的偏离，判为比对结果错误。

1.6 结果分析

根据各比对项目的结果判定标准对参加比对实验室的检测结果进行分析，另外在比对项目设置时，除ASFV 荧光PCR 外的其他3个比对项目在设置时为定性检测，在本文中不做进一步偏离程度分析，只对定量检测比对项目ASFV 荧光PCR 按照CNAS-GL002《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》中方法进行了能力统计量的计算[4]，以相对偏差（D）和Z比分数分析各实验室荧光Ct检测值和给定参考值的差异，计算公式：D=（检测值-参考值）×100%/参考值；Z=（检测值-参考值）/σ，其中σ表示能力评定标准差，根据经验值（预期值）设定为0.2×参考值。本次比对试验中强阳性样品Ct 参考值为25.80，弱阳性样品Ct参考值为29.60。结果分析：|Z|≤2，表明“满意”；2 ＜|Z|＜3，表明“有问题”，产生警戒信号，提醒实验室应引起注意；|Z|≥3，表明“不满意”，产生措施信号，实验室应分析原因，制定针对性整改措施。

2 比对结果

2.1 市、县级实验室比对结果总体情况

参加2019年度辽宁省兽医系统实验室检测能力比对的71家地市、县级兽医实验室均在规定时限内完成比对并上报结果，其中14家地市级、53家县级实验室所有比对项目检测结果全部正确，其余4家比对不合格的县级实验室中，包括1个生猪调出大县实验室有2 份样品检测结果错误、3家其他县级实验室各有1 份样品检测结果错误，总体实验室正确率为94.37%、样品检测结果准确率达99.61%（表2）。

2.2 各比对项目的检测结果情况

参加ASFV 核酸荧光PCR 比对项目的14家地市级和24家生猪调出大县实验室检测结果全部正确，实验室正确率和样品正确率均为100%；参加H7 亚型AIV 抗体HI 试验比对项目的实验室中有2家其他县级实验室各出现1个样品检测结果错误；参加O 型FMDV 抗体阻断ELISA 比对项目的实验室中有1家生猪调出大县、1家其他县级实验室各出现2个和1个样品检测结果错误（表3）。

2.3 ASFV 核酸荧光PCR 比对结果分析

对38个参加该项目比对实验室的检测结果Ct 值进行差异分析表明，尽管均未出现判定结果结论性错误，但实验室间Ct 值差异较大，利用公式进行计算，各实验室比对结果Ct 值的相对偏差与Z比分数见表4，Z比分数情况见图1。结果：|Z|≥3 的实验室共9个，表明为“不满意”结果，占比23.68%；2 ＜|Z|＜3 的实验室共9个，表明为“有问题”结果，占比23.68%；|Z|≤2 的实验室共20个，表明为“满意”结果，占比52.64%。

表2 辽宁省市、县级实验室检测能力比对情况

表3 辽宁省市、县级实验室各比对项目比对结果

表4 辽宁省市、县级实验室ASFV 核酸荧光PCR 比对结果

3 讨论

图1 2019年辽宁省市、县级实验室ASFV核酸PCR 比对Z 比分数结果

从2019年度检测能力比对的总体结果来看，除4个县级实验室在2个血清学检测项目上出现共5个样品较大偏差外，其他实验室均100%正确，实验室总体正确率和样品正确率分别达到94.37%和99.61%。与2017、2018年的总体样品正确率相比，分别提升了0.32 和1.24个百分点，表明经过近年来实施的各级兽医实验室考核，积极推进市县兽医实验室资质认定，持续改进实验室管理体系及开展各项业务技能培训等措施[5]，辽宁省各级兽医实验室在检测能力水平上有一定程度提升，具备了较好完成动物疫病监测、检测的能力。但实验室间仍存在一定差距，地市级实验室的整体水平要高于县级实验室，提示下一步要重点加强县级兽医实验室建设方面投入，采取针对性措施提升县级兽医实验室规范化管理和检测能力。

在2019年度检测能力比对项目的设置中，首次将ASFV 核酸荧光PCR 项目作为辽宁省具备ASFV 检测资质的14个地市和24个生猪调出大县兽医实验的比对项目之一，主要考虑这些兽医实验室持续保持ASFV 检测能力水平是有效防控该病的重要支撑力量。从比对结果来看，参加该比对项目的38个实验室检测结果均未出现结论性错误，但各实验室间荧光PCR 检测结果荧光Ct 值差异较大，从能力统计量计算结果来看，相对偏差较大，|Z|≥3 的实验室有9个（其中地市级2个），表明这些实验室该项目检测能力为“不满意”水平，在检测一些低拷贝含量临床样品中出现错误检测结果的风险较高；另外，也有9个实验室（其中地市级2个）处于2 ＜|Z|＜3 的“有问题”水平，提示这些实验室应引起警戒。因此，建议上述18个实验室应认真查找原因，并采取针对性纠正措施，以进一步提高检测的准确性。

参加PRRSV 抗体间接ELISA 项目的实验室检测结果均100%正确，表明各实验室对该检测项目掌握水平较高，分析可能与间接ELISA 方法操作步骤较少、试剂盒标准化程度较高、检测时间较短等因素有关；鉴于HI 试验是各级兽医实验室最常用的血清学检测技术，近年来，各级实验室加强了对HI 的针对性培训，但辽宁省每年的实验室比对中均有实验室出现较大偏差，也是2019年各比对项目中出错率最高的项目，有2个县级实验室各1个样品检测结果存在较大偏差，分析可能与2018年机构改革后实验室检测人员变动、新的检测人员未严格按照国家标准操作规程操作、进行4 单位抗原配置和回滴不准确、判定结果经验不足等因素有关；在猪O 型FMDV 抗体检测项目中，有2个县级实验室各出现2个和1个样品检测结果偏差较大，分析可能与液相阻断ELISA 试验操作较为繁琐、试剂标准化程度不高等客观因素有关。通过进一步调查显示，这2个实验室均存在检测专职人员不足、老龄化严重、仪器设备老化且缺乏专业化维护等不利因素。

另外，我国兽医领域标准物质极为匮乏，较大程度上影响检测结果的量值溯源过程，从而对实验室间比对的评判尺度一致性产生较大影响。近年来，中国动物疫病预防控制中心牵头开展了多种动物疫病核酸标准物质的研制[6]，截至目前，已有PRRSV 和ASFV 等2种病毒核酸标准物质面世，但远不能满足需求，且抗体方面的标准物质目前仍是空白，导致我国兽医领域检测试剂质量控制和评价方面缺乏“金标准”，严重制约了检测试剂的标准化和规范化进程，一定程度上也影响了实验室间比对结果的准确性和客观公正性。

本次比对试验在ASFV 核酸荧光PCR 比对项目的方案设计上存在一定局限性，应事先规定参加比对的实验室选用的核酸提取试剂盒种类及提取方式，以保证实验室间比对的检测系统等客观因素的一致性。

4 建议

一是建议各级政府部门加强对兽医系统实验室建设和改造升级方面的资金投入，尤其是加强条件较差的县级实验室的投入，促进老旧仪器设备及时更新换代，保证硬件条件满足检测要求；二是建议各级政府部门要着重考虑对检测专职人员紧缺、人员老龄化较严重的实验室年轻专业人才的适时补充，确保人才梯度合理；三是各级兽医实验室要加强人员培训，尤其要加强实验室管理体系建立与运行、检测技能等全方位的持续强化培训，进一步提升实验室规范化、标准化管理水平及检测人员检测技能水平，确保检测结果准确可靠；四是建议实验室能力比对的组织者在比对方案设计时应尽量严谨周密，预先规定好实验室间比对的各项条件（如检测试剂种类、核酸提取方法、检测依据方法和标准等），以确保各实验室间检测系统近可能一致，从而保证比对结果客观公正；五是建议国家组织各方面科研力量加快标准物质的研制和转化应用、加快标准方法的制定和更新，促进兽医领域检测试剂的标准化水平提升。