高效液相色谱法测定盐酸法舒地尔中间体的含量

2020-07-06张亚梅王国伟刘璐

生物化工 2020年3期

张亚梅，王国伟，刘璐

（1.天津天狮学院医学院，天津 301700；2.天津柏海药业有限责任公司，天津 301700）

盐酸法舒地尔注射液是临床上治疗和改善蛛网膜下腔出血使用最多的一种药。该药最早在日本上市，由Asahi Kasei株式会社和Nagoya大学共同研制开发[1]。

国内报道的盐酸法舒地尔原料的合成思路，都是在日本专利的基础上，对分离提纯和溶剂稍加优化，但是合成路线和日本专利基本一致[2-4]。以异喹啉为原料，与发烟硫酸反应得到5-磺酸异喹啉（5-SI），再与SOCl2反应得到5-磺酰氯异喹啉盐酸盐（5-CQH），再与高哌嗪反应得到六氢-1-(5-异喹啉磺酰基)-1(H)-1,4-二氮杂卓，最后再盐酸化、精制，制得目标产物盐酸法舒地尔。合成路线如图1所示。

目前，法舒地尔原料及注射液是国内仿制药申请中非常热门的品种，已经在产和在销的企业，竞争也是异常激烈[5]。为了提高产品质量、安全性和市场竞争力，各企业都在提升内控标准。而提高盐酸法舒地尔原料的纯度，降低杂质的种类和含量，对于提高注射剂质量和安全性、降低临床不良反应是极其重要的环节。研究盐酸法舒地尔合成过程中原料、各中间体的含量测定方法，以便对每个步骤的产物质量进行把关，从而降低终端目标产物的杂质，提高原料药质量和注射剂质量及其安全性。

图1 盐酸法舒地尔合成路线

异喹啉作为起始原料，文献有较多报导其含量检测方法和方法学研究。引用专属性较强的气相色谱法[6]测定异喹啉含量对原料进行把关，检测方便快速。5-磺酸异喹啉是由异喹啉与20%发烟硫酸进行磺化反应而制得。且盐酸法舒地尔注射液在运输和储存过程中，如果保存条件不当，也会降解生成5-SI，给质量和安全性带来很大隐患[7]。目前文献中及各药典均未见收载5-SI的含量检验方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；XS205DU电子天平，瑞士梅特勒托利多公司；PHS-3C酸度计，上海雷磁仪器有限公司；Milli-Q超纯水机，美国密理博公司。

5-SI对照品，批号DZ1205，含量≥99.9%；三乙胺、甲醇、磷酸均为色谱纯，天津康科德科技有限公司；超纯水，自制；5-SI样品3批，市场采购。

5-CQH对照品，批号DL1301，含量≥99.9%；正己烷、异丙醇均为色谱纯，天津科密欧试剂有限公司；超纯水，自制；5-CQH样品3批，市场采购。

1.2 波长的选择

精密称取5-SI对照品适量，加0.5%三乙胺水溶液（用磷酸调pH至7.0）-甲醇（60∶40）进行溶解，并稀释成浓度为 0.06 mg/mL 溶液，在 200～400 nm 区间内进行UV扫描。结果显示，5-SI的最大吸收波长为272 nm，故选择272 nm作为5-SI的检测波长。

精密称取5-CQH对照品适量，加正己烷-异丙醇（90∶10）进行溶解，并稀释成浓度为0.3 mg/mL的溶液，UV扫描测得最大吸收波长为279 nm，作为检测波长。

1.3 色谱条件

5-SI检测采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相0.5%三乙胺水溶液（用磷酸调节pH至7.0）-甲醇（60∶ 40），检测波长 272 nm，流速 0.8 mL/min，柱温 25 ℃，进样量 20 μL。

5-CQH检测采用多糖涂敷型正相手性柱，流动相正己烷-异丙醇（90∶10）混合液，检测波长279 nm，流速 1.0 mL/min，柱温 30 ℃，进样量 20 μL。

1.4 溶液的配制

1.4.1 供试品溶液的配制

精密称取5-SI样品30 mg至100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取2 mL至10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度；摇匀，即得供试品溶液。

精密称取5-CQH样品30 mg至100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得5-CQH供试品溶液。

1.4.2 对照品溶液的配制

精密称取 5-SI对照品 30 mg 至 100 mL 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液；精密量取2 mL至10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度；摇匀，即得对照品溶液。

精密称取5-CQH对照品30 mg至100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得5-CQH对照品溶液。

1.5 检测项目

对5-SI、5-CQH的检测进行系统适用性实验、线性关系及定量限考察、精密度实验、回收率实验、稳定性实验和影响因素实验。

2 结果与分析

2.1 5-SI含量测定

2.1.1 系统适用性实验

仪器自动吸取空白流动相、加异喹啉流动相以及对照品溶液各20 μL，按照1.3色谱条件进样出图。结果显示，空白流动相、加异喹啉流动相均无干扰，对照品出峰时间为3.85 min左右，理论塔板数为10 488，符合要求。

2.1.2 线性关系及定量限考察

分别取1.4.2项下溶液对照品储备液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL 到 10 mL 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得线性对照液1～5号，分别自动进样 20 μL，得方程：A=157 625C+101.01，线性系数为 0.999 8。

结果显示该方法在浓度0.015～0.12 mg/mL的范围内，峰面积与对照液浓度呈良好线性关系，相关系数r=0.999 9，符合要求。当对3号对照液逐级稀释，S/N≥3时，测得5-SI的最低检出限为2.45 ng/mL。

2.1.3 精密度实验

精密度实验中，取3号溶液重复进样9次，相对标准偏差（RSD）为0.047%（n=9）。结果显示，该方法精密度良好。

2.1.4 回收率实验

5-SI在对照品浓度80%、100%和120%三个浓度的加标回收率在98.06%～101.68%，平均回收率99.76%，相对标准偏差为0.76%，符合要求。

2.1.5 稳定性实验

对实际样品进行了放置 0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h的稳定性试验，测得6份样品含量的RSD为0.2%，证明5-SI水溶液在8 h内基本稳定。

2.1.6 影响因素实验

对5-SI进行了干扰实验、高温破坏、强酸破坏、强碱破坏等条件下的试验，观察降解产物的出峰情况。专属性试验，空白溶剂与5-SI对主成分峰无干扰。如图2所示，对样品进行高温破坏和强酸破坏，杂峰无增多，主峰峰面积无减小，且主成分峰与其杂质峰分离良好；如图3所示，对样品进行强碱破坏，在3 min之前的杂质峰增多，且杂质峰峰面积增大，但主成分峰与其杂质峰分离良好，新产生的杂质能够通过此高效液相色谱方法检测出来。

2.1.7 样品含量的测定

精密称取3批样品，按照1.4.1方法配成溶液，测得样品含量分别为98.7%、98.1%、99.8%，每批RSD均小于0.15%，均符合要求。

鉴于以上实验结果，本方法适用于检测盐酸法舒地尔中间体5-SI的含量。

2.2 5-CQH含量测定

5-CQH是由5-SI与氯化亚砜进行氯化反应而制得。因5-CQH结构的特殊性（遇水极易分解）[5]，故选择正相系统进行方法研究其含量测定方法。

2.2.1 系统适用性实验

按照1.3色谱条件进样出图，结果显示，空白溶剂对主成分峰无干扰。对照品出峰时间为14.2 min左右，理论塔板数符合要求。

2.2.2 线性关系及定量限考察

该方法在浓度0.1～0.6 mg/mL范围内，峰面积与样品中目标化合物浓度呈良好线性关系，相关系数r=0.998 9。当S/N≥3时，测得最低检出限为0.041 μg/mL。

2.2.3 精密度实验

精密度实验中，取0.3 mg/mL的5-CQH溶液重复进样9次，RSD为0.5%。证明该方法精密度良好。

2.2.4 回收率实验

5-CQH在对照品浓度的80%、100%和120%三个浓度的加标回收率在98.05%～99.44%，平均回收率98.22%，相对标准偏差为0.9%，符合要求。

2.2.5 稳定性实验

采用该方法对实际样品进行了放置0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 的稳定性试验，测得 6 份样品含量的RSD为0.5%，证明5-CQH在8 h内基本稳定。

2.2.6 影响因素实验

因5-CQH遇水分解，本方法是在非水环境下进行测定，不再进行强酸、强碱实验。本研究进行了干扰实验、高温破坏、光照实验等，观察稳定性情况。取化合物 5-CQH 3 mg置 100 mL 量瓶中，其溶液呈混悬液，不溶解于异丙醇，进样前用0.22 μm膜进行过滤，可以除去5-磺酸异喹啉对本方法的干扰。将5-CQH放置在 50 ℃、100 ℃烘箱中分别加热 5 h，50 ℃检测含量没有明显变化，但是100 ℃加热以后，已被破坏不再溶于异丙醇。将样品放置在 1 000～1 500 Lx光照条件下照射8 h，按有关物质色谱条件进行测定。如图4所示，为5-CQH光照试验结果，5-CQH光照后对主成分峰无破坏。