沉积物再悬浮对长江口潮滩上覆水体脱氮过程的影响

张红丽 尹国宇 郑艳玲 高娟 高灯州 常永凯 刘程

摘要：以长江口潮滩作为研究区域，采用¹⁶N同位素示踪技术，模拟研究了沉积物再悬浮过程对水体反硝化和厌氧氨氧化的影响，结果表明，沉积物再悬浮引起的上覆水体反硝化和厌氧氨氧化速率与水体浊度呈显著的正相关关系，这说明沉积物再悬浮能够促进水体脱氮过程的发生，在沉积物再悬浮条件下，采样点反硝化与厌氧氨氧化速率受不同站位理化因素的影响，存在明显的空间差异，且主要受沉积物总有机碳含量的控制，此外，随着沉积物再悬浮浊度的增加，水体中反硝化细菌nits基因与厌氧氨氧化细菌16SrRNA基因丰度均呈增加趋势，这说明沉积物再悬浮可增加水体脱氮功能菌群的丰度，进而增加脱氮速率，研究结果表明，评价河口潮滩沉积物再悬浮对氮转化过程的影响具有重要的科学意义。

关键词：再悬浮：浊度：反硝化：厌氧氨氧化

中图分类号：X55文献标志码：A DOI：10.3969/j，issn，1000-5641.201941007

0引言

随着工农业的发展，大量的活性氮通过河流、地下水以及大气沉降等方式进入河口湿地生态系统，导致河口水体富营养化和有害藻类赤潮频繁暴发，反硝化和厌氧氨氧化作为氮循环关键过程，可以将水生生态系统中的生物有效性氮转化为氮气，是去除活性氮的重要途径，对河口生态环境具有重要的作用，目前，由于反硝化和厌氧氨氧化过程被认为是在缺氧或厌氧环境中发生，河口湿地反硝化和厌氧氨氧化的研究主要集中在沉积物或沉积物一水界面，然而，上覆水体颗粒物也是反硝化和厌氧氨氧化过程发生的关键微界面，因此，研究河口湿地沉积物再悬浮对反硝化和厌氧氨氧化过程的影响对于深入认识河口环境氮循环机理具有重要意义。

目前，大量研究发现，可利用性氮、有机质、硫化物、温度、盐度和溶解氧等是影响河口潮滩脱氮过程的主要因素，近年来，有研究表明水动力引起的沉积物再悬浮会影响氮形态及循环过程，如Liu等的研究发现，在含氧水体的悬浮泥沙上存在反硝化过程，其速率随着悬浮泥沙浓度的增加而增大，然而，以往沉积物再悬浮对氮循环影响的研究主要集中在河流，对河口潮滩湿地沉积物再悬浮作用下脱氮过程变化的认识还鲜见报道，河口潮滩湿地作为海陆相互作用的过渡地带，潮流和波浪水动力强烈，沉积物再悬浮过程明显因此，开展沉积物再悬浮对河口潮滩上覆水体脱氮过程的影响研究具有重要的科学价值和环境意义。

基于此，选取地处我国工业化程度高、人口最为密集，并且由于潮汐作用的顶托，大量的泥沙在该地区停滞、沉积的长江口潮滩湿地作为研究区域，通过野外采样及室内模拟实验，开展沉积物再悬浮对反硝化和厌氧氨氧化的影响，并探讨沉积物环境因素对反硝化与厌氧氨氧化的影响特征，以期为深入认识河口氮循环过程和氮污染控制提供重要的理论依据。

1材料与方法

1.1样品采集

沿着长江口，选取浒浦（xP）、浏河口（LHK）、石洞口（sDK）、白龙港（BLG）、东海农场（DHNC）以及芦潮港（LCG）6个站位（见图1），于2017年10月，采集每个站位沉积物和上覆水，采用有机玻璃柱（直径24cm，高40cm）采集原位柱状沉积物，采水瓶采集5L原位水，样品采集完后立即带回实验室，一部分保存于4℃，用于理化性质分析;一部分沉积物装入培养装置中，加入原位水进行培养实验;另一部分保存于-80℃，用于进行分子生物学实验，

1.2理化性质分析

采用YSI 30型盐度计和Merrier-Toledo pH计分别测定沉积物（水土质量比为2.5：1）的盐度和pH利用烘干法测定土壤含水量，沉积物粒度使用LSl3320激光粒度分析仪（Backmanconlter，USA）分析，采用邻菲罗啉比色法测定活性铁，首先以1mol-L^-1HCI萃取，Fe（Ⅱ）直接加显色剂显色测定，Fe（Ⅲ）加适量盐酸羟胺将Fe（Ⅲ）还原为Fe（Ⅱ）再进行测定，采用碳氮元素分析仪（VarioELⅢ）分析沉积物有机碳（Total organic carbon，TOC），采用硫化銀电极（Thermo Scientific Orion）测定沉积物硫化物，检测限为0.09ILmol-L^-1，使用2mol-L^-1的KC1萃取上覆水中NO3^-、NO2^-和NH4⁺，然后使用连续流动分析仪（sKALAR SAN++，Netherlands）测定，每项理化参数进行3个平行分析，

1.3连续流培养实验

培养实验采用自行设计的模拟再悬浮系统实验装置（见图2），该装置可通过调节螺旋桨转速，模拟不同沉积物再悬浮引起的不同浊度，装置罐身为有机玻璃柱，外径240mm，壁厚5mm，高400mm，上部与磁力搅拌机通过密封环连接;下部是塑料挡板与密封环镶嵌式底座，在密封环上留有进样孔、出样孔以及传感器探头孔，通过浊度传感器与温度传感器可实时监控装置内的浊度与温度情况，连续进出水可保证培养罐内一直处于有氧环境，最大程度上模拟野外环境，实验前使用真空泵抽气，检测装置气密性，使装置内部压强降到0.9个压强，并且可以保持24h。

将采集的原位柱状沉积物样品置于实验装置中，装置气密性检查合格后，通过蠕动泵输入添加15N03浓度达到100umol·L^-1的原位水样，稳定24h后，启动搅拌装置，将悬浮泥沙浊度按照潮滩上覆水在潮周期内浊度的变化范围分为100NTU，200NTU，300NTU，400NTU及不悬浮（O NTU）（NephelometricTurbidity Unit散射浊度）5种情况，对应悬浮颗粒物浓度在0-10g·L^-1之间，分别进行培养，再稳定24h后使得沉积物与水之间达到稳定交换状态，24h后，每3h用12.5mL的玻璃气密小瓶（12.5mLExetainer，Labco，High Wycombe，UK）采集一次入水口和出水口的水样，每天5次，用于反硝化、厌氧氨氧化速率的测定，结果取平均值，样本收集后，在每个样品中注射200ul50%ZnCl2抑制微生物活性，此外，选取SDK站位样品，在沉积物连续流培养期间，每3h取一次水样，每天5次，用于DNA的提取以及定量PCR分析，结果取平均值，培养期间培养室室温始终控制在20℃左右，实验期间对溶氧进行了实时监控，溶氧范围为8.01～9.08mg·L^-1。

1.4反硝化与厌氧氨氧化速率的计算

1.6统计分析

采用SPSS 22.0软件（sPSS Inc，USA）进行数据统计分析，利用单因素方差分析反硝化和厌氧氨氧化的空间差异，使用Pearson进行相关分析，图采用Origin 8.0软件绘制，

2结果

2.1沉积物理化性质及微生物组成

采样点沉积物理化性质如表1所示，沉积物盐度为0.1～0.8psu，其中LCG和DHNC站位高于其他站位，pH值为7.58～8.17.最高值出现在BLG站位，沉积物主要由黏土（4%）和粉砂土（94%）组成，砂含量较低（2%），平均粒径为12.21～22.96um，其中SDK的平均粒径最大，沉积物中铁氧化物含量为0.15～0.36mg·g-1，，次铁氧化物含量为0.29～0.43mg，g-1.沉积物有机碳和硫化物的浓度分别为4.79～11.97mg·g-1和0.06～3.00ug·g-1.均在SDK站位最高，且SDK硫化物浓度远高于其他站位，沉积物中NO3-浓度范围为110.77～290.38umol·g-1而与NO3-含量相比，区内NH4+含量和NO2-含量较低，分别为0.03～1.58umol·g-1和0.06～0.14umol·g-1反硝化nits基因丰度在7.16×10⁶-9.28×107+之间，其中，SDK的基因丰度最大，厌氧氨氧化16S rRNA基因丰度在4.13×105～8.33×10s之间，16S rRNA基因丰度的最大值也是在SDK站位，

2.2沉积物再悬浮对脱氮过程的影响

沉积物反硝化速率为35.59～3492.08mg N，m^-2d-1.且随着浊度增加而增加，具有良好的线性关系（见图3），以SDK为例，其速率与浊度的线性表达式为y=7.98x+469.77.R²=0.852.其中，SDK站位的反硝化速率增长量最大，为3492.08mg N，m^-2.d-1;DHNC次之，为2470.57mg N，m^-2.d-1;BLG站位的反硝化速率增长量最小，为326.46mg N·m^-2·d-1.SDK和DHNC站位的反硝化速率对沉积物再悬浮浊度响应较为敏感，其反硝化速率显著增加（one-way ANOVA，F=4.7787.df=29.p<0.01），除了0和100NTU，在同一浊度下，SDK和DHNC站位的反硝化速率高于其他站位，

不同浊度下沉积物再悬浮对厌氧氨氧化速率如图4所示，随着浊度的变化，厌氧氨氧化速率变化为1.65～143.54mg N·m^-2.d-1.与反硝化速率对再悬浮的响应相似，不同站位厌氧氨氧化速率总体上也均随着浊度增加而增加，且具有良好的线性关系，以LCG为例，其速率与浊度的线性表达式为y=0.219x+14.134.R²=0.828.其中，SDK站位的厌氧氨氧化速率增长量最大，为126.22mg N·m^-2·d-1;BLG站位的厌氧氨氧化速率增长量最小，为35.12mg N·m^-2·d-1.SDK、LCG、LHK和XP站位的厌氧氨氧化速率对沉积物再悬浮浊度响应较为敏感，其厌氧氨氧化速率显著增加（one-way ANOVA，F=13.1710.df=29.p<0.05），在同一浊度下，BLG和DHNC站位的厌氧氨氧化速率低于其他站位，

经冗余分析（RDA分析），明确了反硝化、厌氧氨氧化过程在不悬浮和再悬浮状态下与环境因子之间的关系（见图5），两个主坐标对所有样点反硝化和厌氧氨氧化速率的解释贡献均为100%，在不悬浮状态下，反硝化速率和厌氧氨氧化速率与硫化物、平均粒径、TOC、NO2^-、Fe3+呈正相关，其中反硝化速率与硫化物显著相关（p<0.01），占RDA总解释量的85%，而在再悬浮状态下，反硝化速率和厌氧氨氧化速率与TOC、平均粒径、N02、Fd³⁺、盐度、硫化物呈正相关，其中反硝化速率与TOC浓度显著相关（p<0.05），占RDA总解释量的81%，结果中，其他环境因子的贡献均不显著（p>0.05），

再悬浮状态下，反硝化过程的脱氮贡献率占到81%～99%，而厌氧氨氧化过程的脱氮贡献率仅占1%-19%（见图6），这说明在长江口潮滩再悬浮状态下，反硝化过程是主要的脱氮过程，而且，在不同站位，浊度与反硝化和厌氧氨氧化占整体脱氮的比例没有明显相关关系（p>0.05）。

2.3反硝化细菌（nits基因）和厌氧氨氧化细菌（16s rRNA基因）丰度

SDK站位不同浊度反硝化nits和厌氧氨氧化16S rRNA基因丰度见图7.nits基因丰度为1.04×104+～2.68×105+ copies-L-1.与悬浮浊度呈显著正相关（p<0.05），16S rRNA基因丰度为1.31×103+-1.93×104copies，L=1.与反硝化细菌nits基因变化特征相似，厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度随着悬浮浊度增加而增加（p<0.01），反硝化和厌氧氨氧化速率与反硝化细菌nits和厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度相关分析显示（见图8），反硝化细菌nits基因丰度与反硝化速率呈极显著正相关（R=0.838.p<0.01），厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度与厌氧氨氧化速率呈显著正相关（R=0.763.p<0.01）。

3讨论

长江口处于高氮负荷的河口生态区，又受到潮汐、径流、波浪和风暴潮等动力因子的影响造成沉积物再悬浮，从而引起生源要素在沉积物和水体的再分配，进而影响氮素的生物地球化学循环，因此，研究沉积物再悬浮对反硝化和厌氧氨氧化过程的影响对改善长江口生态环境具有重要的环境意义，以往的研究主要基于沉积物研究脱氮过程，对发生再悬浮的上覆水体中的脱氮过程缺乏足够的认识，本研究采用再悬浮模拟实验，得出长江口湿地沉积物再悬浮对上覆水体的反硝化和厌氧氨氧化过程具有显著的影响，其脱氮速率随着再悬浮沉积物浊度的增加而增加，再悬浮状态下，不同站位反硝化速率对沉积物再悬浮浊度响应存在明顯差异，且主要受总有机碳的影响，nirS和16S rRNA基因丰度随着悬浮泥沙浊度的增加也都呈增加的趋势。

本研究中反硝化和厌氧氨氧化速率随着再悬浮浊度的增大而增大，与淡水生态系统的研究结果相一致，一般认为，再悬浮引起的氧溶解能促进硝化作用的发生，进而促使硝酸根的生成速率加快，为反硝化和厌氧氨氧化过程提供反应基质;发生再悬浮时水体的流动以及悬浮泥沙周围存在大量的厌氧微空间，为反硝化和厌氧氨氧化过程提供反应场所1.反硝化过程是主要的脱氮过程，与此前长江口及近岸水域研究结果相同，反硝化是长江口边滩最重要的活性氮削减过程，反硝化贡献率在85%左右，厌氧氨氧化贡献率在15%左右，而且，在不同站位，浊度对于反硝化和厌氧氨氧化占整体脱氮的比例没有显著影响，这可能是由于浊度对反硝化和厌氧氨氧化速率的影响程度较为接近，此前有研究表明，长江口沉积物中由于反硝化菌可以为厌氧氨氧化菌提供主要的亚硝氮来源，厌氧氨氧化速率与反硝化速率存在显著正相关关系，所以，在再悬浮状态下可能也存在这种机制，造成二者变化程度差别不大。

不同站位在再悬浮条件下，反硝化速率和厌氧氨氧化速率对沉积物再悬浮浊度响应不同，这可能与再悬浮条件下的背景理化性质有关，研究发现，再悬浮可以改变理化性质对于反硝化和厌氧氨氧化速率的影响情况，此外，本研究发现，DHNC和SDK站位的反硝化速率高于其他站位，沉积物理化性质分析结果表明，SDK和DHNC站位沉积物TOC含量总体上高于其他站位，在高浊度下，SDK和DHNC站点再悬浮沉积物有机碳和反硝化细菌数量可能会急剧增加，进而导致反硝化速率显著提高，一般而言，反硝化速率与可利用性碳氮基质密切相关，其中有机碳为反硝化过程提供必要电子，—定浓度下，有机质的增加会促进反硝化过程，同时有机碳还会影响微生物的生长，进而对反硝化过程产生刺激作用，调查发现，SDK站点位于上海市最大的污水处理场附近，含有大量有机物质的污水排放增加了该站点沉积物有机碳含量，而废水排放，有机物质分解消耗氧气，形成一个相对厌氧的环境，这有利于厌氧微生物细菌的生长，而DHNC由大量芦苇、互花米草和海三棱蔗草等植被覆盖，尤其是芦苇和互花米草具有较高的初级生产力和固碳能力，这可为该站点提供一定数量和质量的有机质，在各采样点中，SDK的硫化物含量最高，硫氧化细菌在代谢过程中会以硝酸盐作为电子受体，进而促进反硝化的进行l引，此外，厌氧氨氧化对浊度响应的研究结果表明，SDK、LCG、LHK和XP的厌氧氨氧化速率对浊度的响应较BLG和DHNC更为明显，且在同一浊度下，BLG和DHNC厌氧氨氧化速率总体上也低于其他站点，产生这一现象可能与盐度和NH4+等理化性质有关，有研究表明，高盐度会在一定程度上抑制厌氧氨氧化速率，基于这一理论，LCG和DHNC会有较低的厌氧氨氧化速率，然而LCG并没有呈现这一特征，这可能主要是因为LCG具有较高的NH4+含量，在再悬浮条件下为厌氧氨氧化过程提供机制，进而促进了其厌氧氨氧化速率，此外，LCG沉積物的平均粒径显著小于其他采样点，有研究指出，粒径越小，比表面积越大，厌氧氨氧化细菌数量越多，与NO3-接触的范围越广，这也会促进厌氧氨氧化速率。

为了进一步探究河口湿地沉积物再悬浮对脱氮过程的微生物驱动机制，我们选取了SDK站位，研究了浊度与反硝化细菌nits和厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度的关系，nits和16S rRNA基因丰度均随着悬浮泥沙浊度的增加呈增加的趋势，主要原因可能是在上覆水体中，细菌主要附着在悬浮颗粒物上，因此，增大再悬浮沉积物的浊度，基因的丰度就会随之增加，在悬浮颗粒物表面存在大量的厌氧微空间，为反硝化和厌氧氨氧化细菌提供了适宜的环境，进而增加了反硝化和厌氧氨氧化菌群的活性，此外，本研究相关性分析结果表明，nits和16S rRNA基因丰度分别与反硝化和厌氧氨氧化速率呈显著正相关，李佳霖等也发现，在长江口海域夏季沉积物中反硝化细菌丰度与反硝化速率呈显著相关，这说明反硝化细菌和厌氧氨氧化菌的数量分别是影响反硝化和厌氧氨氧化速率的主要原因之一，这些研究结果表明，在河口湿地生态系统中通过剧烈的再悬浮过程，增加了功能微生物丰度，进而促进相关过程的速率，然而，本研究仅对再悬浮引起的微生物基因丰度变化与速率的关系进行了探讨，之后可以通过测序等手段进一步分析菌群组成和结构的变化，以便更好地理解再悬浮对脱氮过程的影响机制。

根据本研究模拟得出的平均反硝化速率和厌氧氨氧化速率，假设发生再悬浮的边滩平均水深为1m，估计反硝化速率为630.72kg·km^-2.a-1.厌氧氨氧化速率为25.89kg·km^-2.a-1.这也说明了由再悬浮引起的脱氮过程对河口生态系统氮循环过程产生了重要的影响，然而，由于研究区环境因素和脱氮过程具有较大的时空差异，所估算的结果具有一定的不确定性，此外，室内控制实验可能会高估野外环境的速率，因此，后续的研究还应加强野外实验的研究，从而得出更加可靠的实验结果，

4结论

（1）沉积物再悬浮对反硝化和厌氧氨氧化速率具有重要的影响，速率随着再悬浮沉积物浊度的增加而增大。

（2）在再悬浮条件下，悬浮水体反硝化和厌氧氨氧化受不同站位背景理化因素影响，其中，TOC含量是影响的主要因素。

（3）反硝化细菌nits和厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度均随着沉积物悬浮浊度的增加而显著增加。