河北地区Rh部分D变异型的基因分布特点

乔 芳, 王 宁, 王远花, 钱明明, 郭 霞, 赵 倩, 田亚娟

(河北省血液中心配型科, 河北 石家庄 050071)

国际输血协会(ISBT)命名的人类红细胞36个血型系统中，Rh血型系统是其中最复杂的一个，与溶血性反应、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血等疾病存在重要关系[1]。Rh血型系统有5种抗原，分别是C、c、D、E、e抗原。其中免疫原性最强的是D抗原，具有非常重要的临床意义[2]。RhD阴性的个体，在中国人群中约占0.3%～0.5%。RhD变异型定义为用盐水法检测为阴性，通过间接抗人球蛋白实验(IAT)才能检出的表型。RhD抗原存在多种变异型，根据其在红细胞上质和量的改变可分为部分D、弱D和Del型。本研究采用阴性确认实验检测出RhD变异型，进一步通过基因分型技术研究RhD变异型中部分D标本的分子背景。通过对河北地区Rh阴性无偿献血者进行部分D基因型分析，现报道如下。

1 对象与方法

1.1对象:2016年期间河北省血液中心汉族无亲缘关系的RhD阴性献血者，血型血清学鉴定为RhD变异型的个体107例。

1.2血型血清学实验:三种抗-D血清分别是IgM+IgG抗-D1(IMMUCOR，批号：517097)，IgM+IgG抗-D2(MILLIPORE，批号：BMA1402C)， IgG抗-D3(上海血液生物医药有限公司，批号20150128)、抗-C(上海血液生物医药有限公司，批号：20143005)、抗-c(上海血液生物医药有限公司，批号：20153101)、抗-E(上海血液生物医药有限公司，批号：20153201)和抗-e(上海血液生物医药有限公司，批号：20153302)。

1.3基因组DNA制备:按照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃保存备用。TaqDNA聚合酶(PROMAGA，0000175632)；人类红细胞RhD血型-弱D(部分D)基因分型试剂盒(天津秀鹏生物技术公司，201603013，201603012)。

1.4RhD基因特异性外显子的PCR检测

1.4.1序列特异性引物(sequence specific primers, SSP)扩增：RHD基因特异性引物，对RHD基因特异性外显子第3、4、5、6、7、9外显子和内对照引物HGH(human growth hormone, HGH)进行基因特异性扩增(见表1)。

1.4.2PCR检测：PCR反应体系总体积10μl，5U/μl GoTaq DNA聚合酶 (Promega, 0000175632)。PCR反应条件为95℃ 2min, 94℃ 30s, 55℃ 45s, 72℃ 1min, 35个循环，最后72℃ 10min。PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯成像并分析结果。

表1 RHD特异外显子的PCR-SSP引物序列及扩增产物大小

表2 人类红细胞RhD血型-部分D基因分型试剂盒扩增参数

1.5Rh部分D变异型的基因分型(PCR-SSP)：经RHD特异性外显子扩增检出的Rh部分D变异型的样本，采用人类红细胞Rh部分D基因分型试剂盒(天津市秀鹏生物技术开发有限公司)进行基因的分型，根据电泳结果分型表判读基因分型结果。按照试剂说明书要求配制扩增体系，PCR扩增参数设置(见表2)。

2 结 果

2.1血清学分析：经IAT确认为D变异型的样本，用PCR-SSP方法检测出部分D基因型14例(图1)。

2.2RhD变异体中Rh表型和RhD外显子分布：见表3。

表3 Rh因子分型和RhD外显子分布

2.3RhD变异型中部分D标本的基因型检测：对检出的14例部分D的标本进一步应用PCR-SSP方法(天津秀鹏生物技术公司)进行基因分型，结果为：11例为D cat.VI type3型(图2)；2例为D cat.Va type2型(图3)；1例为D cat.IIIc型(图4)。

图1 RHD基因第3、4、5、6、7、9外显子特异性PCR扩增产物

左图为具有完整特异性RHD基因，右图为外显子3、4、5、6缺失

图2 检测部分D标本的D cat.VI type3*基因型检测结果

图3 检测部分D标本的D cat.Va type2*基因型检测结果

图4 检测部分D标本的D cat.IIIc基因型检测结果

3 讨 论

Rh血型系统是人类红细胞中最复杂的血型系统之一，其重要性表现在Rh血型基因背景的复杂性和抗原表达的强弱不一等方面。RhD蛋白在红细胞膜上经过12次穿膜，有六个结构域。D变异型分为弱D和部分D；弱D抗原的改变位于细胞膜中和膜内，抗原改变表现为只有数量的改变，却未发生质的变化；部分D抗原的改变则发生于细胞膜外，而未发现抗原的量和质的变化[3]。RhD抗原是由RHD基因编码，该基因位于人类1号染色体短臂；RHD基因和RHCE基因均由10个外显子组成，是串联排列而成，编码区长度为1251bp，D基因和CE基因分别编码417个氨基酸，并组成糖蛋白：即为D抗原和CcEe抗原。

部分D的分子基础包括三种类型：单个错义突变、多个错义突变和RHD/CE融合等位基因[4]。任何原因导致基因的改变均可能造成抗原的蛋白质的结构发生变化。商品化的多种抗-D血清试剂与D抗原结合的位点不尽相同，与同一抗原决定簇发生反应，它们的结合强度也会有所不同。因此，不同商品化的抗-D血清试剂与表达D抗原变异型的红细胞在不同条件下反应格局会有所不同[5]。采用PCR-SSP方法对河北地区检出的107例D变异型标本进行部分D的基因分型，检出14例部分D的标本中，11例为D cat.VI type3型，为主要分布的Rh部分D的基因型占78.6%；其他3例基因型中，2例为D cat.Va type2型，约占14.3%；1例为D cat.IIIc型约占7.1%。

RhD变异体中，有研究报道部分D个体易产生抗-D抗体。部分D变异体分6类(DⅡ～DⅦ)，其存在种族和地域多态性。在非洲或非洲裔人群中，DⅢa和DAR是最易产生抗- D的D变异体；而在高加索人群中，最易产生抗-D的RhD变异体是DⅥ；中国人群中部分D变异型中最常见的基因型是DⅥ[6,7]。DVI型按照RHD基因被RHCE基因替换的位置不同又分为4型，分别为RHD基因缺失D4、D5；缺失D4、D6；缺失D3～6和缺失D3～5外显子，均是RHD基因和RHCE基因杂交的产物，对应的基因结构分别为D cat.VI type1；D cat.VI type2；D cat.VI type3和D cat.VI type4[8]。本次研究报道的这11例部分D变异体为D cat.VI type3，是RHD基因第3～6外显子被RHCE基因替换形成的杂交基因。国内很少有关于DVI type 3型产生抗-D抗体的报道，马印图等[9]曾报道有1例产生抗-D抗体，且效价达到128的病例。本研究中检出2例D cat.VI type2型，检出1例D cat.IIIc型，具有地区差异性。虽然检测标本均为健康献血者，但是对于他们在今后遇到输血相关疾病时，即使没有检测到抗-D的存在，作为受血者，确定其RhD基因型对于选择适合的血液产品尤为重要，以尽可能减少免疫抗体的产生而造成输血困难。因此在临床输血实践过程中，要足够重视部分D表型为DVI type 3型的患者或孕妇。对于没有产生抗-D抗体的部分D表型的孕妇，可以在孕期注射抗D免疫球蛋白，使其与新生儿RhD阳性细胞结合，封闭和抑制免疫反应的发生，从而达到预防其产生抗-D的可能性，避免胎儿发生溶血。

研究D变异型的分子背景，建立简便准确的基因定型方法，对于血清学检测方法是有效的补充和完善，从而制定出针对不同个体的输血策略，对于临床安全、科学、合理用血以及孕妇、新生儿溶血病的预防，诊断及治疗都有十分重要的临床意义。