LncRNA MEG3在病毒性毛细支气管炎患儿外周血单个核细胞和痰液中表达及意义

朱连海， 何长生， 申建伟， 杨丹平， 胡诤贇

(1.上海市松江区九亭医院儿科， 上海 松江区 201600 2.上海市松江区中心医院儿科， 上海 松江区 201600)

毛细支气管炎是一种下呼吸道感染性疾病，以呼吸道合胞病毒引发的病毒性毛细支气管炎最为常见，多发于2岁以下尤其是2～6个月婴幼儿群体。由于遗传、免疫力低、生活环境差、流行性疾病等影响，近年来病毒性毛细支气管炎发病率呈递增趋势[1]。病毒性毛细支气管炎进展极快，年龄小于6个月患儿死亡率高，且治疗后多出现哮喘等并发症，严重影响患儿生存及生活质量[2]。及时诊断和采取有效治疗对控制病情发生发展，改善患儿预后有重要意义。病毒性毛细支气管炎发生发展与呼吸道合胞病毒和炎症反应有关。Tao等研究发现，呼吸道合胞病毒感染的鼻咽癌患者肿瘤组织中LncRNA MEG3(maternally expressed gene 3，母系表达基因3)低表达，可能通过影响肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素(IL)-8水平，阻止呼吸道上皮细胞感染呼吸道合胞病毒[3]。由于LncRNA MEG3在病毒性毛细支气管炎发生发展中未有研究，本研究通过检测病毒性毛细支气管炎患儿外周血单个核细胞和痰液中LncRNA MEG3表达水平，分析其与患儿临床病理特征及预后关系，探究其临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2017年2月至2019年1月上海市松江区九亭医院和上海市松江区中心医院收治的病毒性毛细支气管炎患儿103例，其中男性患儿69例，女性患儿34例，年龄4～25个月，平均(12.67±3.85)个月。根据毛细支气管炎临床病情严重程度分为三组：轻度组41例，中度组35例，重度组27例。纳入标准：①均符合病毒性毛细支气管炎诊断标准。②入组患儿均在患病3d内入院，且2周内无类固醇激素使用史。③临床及预后资料完整。排除标准：①合并患有先天性心脏病。②有免疫缺陷。③合并肺结核等肺部感染。另选取同期体检显示健康婴幼儿103例为对照组。其中男性71例，女性32例，年龄5～24个月，平均(13.04±4.12)岁。所有入组患儿及健康婴幼儿家属均对本研究知情，并签署知情同意书。本研究经上海市松江区中心医院伦理委员会批准同意。

1.2主要仪器和试剂:实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：7500，美国ABI公司)；SYBR PrimeScriptTM qRT-PCR试剂盒(批号：RR820a，大连宝生物工程有限公司)；反转录试剂盒(Reverse transcriptase Kit，批号：RP1105，北京索莱宝科技有限公司)；RNA提取试剂盒(Trizol Reagent RNA，批号：R1200-100，北京索莱宝科技有限公司)。

1.3方 法

1.3.1样本采集:入组患儿及健康婴幼儿分别于入院当天及体检时抽取外周静脉血3mL，采用Ficoll-Hypaque分离液分离并获取外周血单个核细胞(PBMCs)，将细胞数调整为1×109L-1，在CO2饱和湿度下育孵5h后收集细胞，于-80℃冰箱保存备用。入组健康婴幼儿采用喉部轻压刺激法收集痰液。入组患儿于入院当天进行生理盐水口腔清洁后，常规拍背吸痰，痰液量较少则给予3%NaCl氧驱雾化吸入15min后重新吸痰，保证收集痰液量≥1.5mL。所收集痰液2h内检测合格后，加入4倍体积的1%二硫苏糖醇、等体积磷酸盐缓冲液，经震荡、离心后取上清液于-80℃冰箱保存备用。

1.3.2qRT-PCR法检测患儿外周血单个核细胞和痰液中LncRNA MEG3表达:采用Trizol法分别提取外周血单个核细胞和痰液总RNA，反转录为cDNA后，用于qRT-PCR。qRT-PCR反应体系(20μL)如下：0.8μL上游引物，0.8μL下游引物，2μL cDNA，10μL SYBR Primix Ex TaqTM，0.4μL ROX Dye II，6μL ddH2O，反应程序如下：95℃、33s，1循环；95℃、5s，62℃、32s，以上40个循环，一个样品进行三次重复。采用2-△△CT法计算外周血单个核细胞和痰液中LncRNA MEG3和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA相对表达量。qRT-PCR引物如表1所示，以GAPDH为内参基因。本实验与上海徕创生物科技有限公司合作进行。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4随访:所有入组患儿经治疗出院后，每3个月以电话或复查形式对其进行随访，以哮喘发作为主要终点事件，随访至2019年7月截止。

2 结 果

表2 不同患病程度患儿外周血单个核细胞中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度组比较，#P<0.05；与中度组比较，△P<0.05

2.1不同患病程度患儿外周血单个核细胞中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表达水平比较:对照、轻度、中度和重度组患儿外周血单个核细胞中LncRNA MEG3表达水平依次显著降低，两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。对照、轻度、中度和重度组患儿外周血单个核细胞中VEGF mRNA表达水平依次显著升高，两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)，见表2。

2.2不同患病程度患儿痰液中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表达水平比较:对照、轻度、中度和重度组患儿痰液中LncRNA MEG3表达水平依次显著降低，两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。对照、轻度、中度和重度组患儿痰液中VEGF mRNA表达水平依次显著升高，两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)，见表3。

表3 不同患病程度患儿痰液中LncRNA MEG3和VEGF mRNA表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度组比较，#P<0.05；与中度组比较，△P<0.05

2.3患儿外周血单个核细胞中及痰液中LncRNA MEG3与VEGF mRNA水平相关性:如图1和图2所示，患儿外周血单个核细胞中及痰液中LncRNA MEG3表达水平与VEGF mRNA表达水平均呈负相关(r=-0.417，P<0.001；r=-0.560，P<0.001)。

2.4不同临床特征及预后患儿外周血单个核细胞中及痰液中LncRNA MEG3水平比较:不同性别、年龄患儿外周血单个核细胞及痰液中LncRNA MEG3表达水平比较，差异无统计学意义(P均>0.05)。有过敏史患儿外周血单个核细胞及痰液中LncRNA MEG3表达水平显著低于无过敏史患儿(P<0.05)。治疗出院后并发哮喘患儿外周血单个核细胞及痰液中LncRNA MEG3表达水平明显低于未并发哮喘患儿(P<0.05)，见表4。

表4 患儿单个核细胞中及痰液中LncRNA MEG3水平与临床特征及预后关系

2.5病毒性毛细支气管炎患儿不良预后影响因素分析:logistic回归分析可知，有过敏史、VEGF高表达、LncRNA MEG3低表达是影响病毒性毛细支气管炎患儿发生不良预后危险因素(P均<0.05)，见表5。

表5 病毒性毛细支气管炎患儿不良预后影响因素分析

图1 患儿外周血单个核细胞中LncRNA MEG3与VEGF mRNA水平相关性

图2 患儿痰液中LncRNA MEG3与VEGF mRNA水平相关性

3 讨 论

病毒性毛细支气管炎常发生在上呼吸道感染后，表现为持续性干咳、发热、憋喘等，憋喘后患儿病情持续加重，出现呼气延长、喘鸣、口周发青、脸色苍白、呻吟不止等症状。若不能及时治疗，疾病可能进展至心力或呼吸衰竭，严重威胁患儿生命安全[4,5]。探寻该疾病生物标志物，有助于及时治疗和患者预后改善。

LncRNA是长度大于200核苷酸的具有调控功能的非编码RNA，可参与多种疾病进展。Zhang等研究发现，下调LncRNA BCYRN1可通过调控气道平滑肌细胞增殖和迁移能力，抑制哮喘症进展[6]。Li等在慢性阻塞性肺疾病中研究发现，下调LncRNA MEG3可抑制支气管上皮细胞凋亡和自噬[7]。以上研究提示，LncRNA与呼吸道疾病发生发展有关。本研究结果显示，病毒性毛细支气管患儿患儿外周血单个核细胞和痰液中LncRNA MEG3表达水平明显低于对照组，提示LncRNA MEG3可能与病毒性毛细支气管炎发生有关。进一步研究发现，轻度、中度和重度组患儿外周血单个核细胞和痰液中LncRNA MEG3表达水平依次显著降低，两两比较差异有统计学意义，提示LncRNA MEG3可能与病毒性毛细支气管炎发展有关。

有研究表明，LncRNA MEG3在皮肤黑色素瘤细胞中表达明显减少，过表达可抑制黑色素瘤细胞增殖和侵袭能力[8]。Zhang等研究证实，与健康对照组相比，LncRNA MEG3在糖尿病性视网膜患者血清中表达水平显著降低，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)表达水平显著升高，过表达LncRNA MEG3可通过下调VEGF、TGF-β表达抑制糖尿病性视网膜病变发展[9]。本研究结果显示，对照、轻度、中度和重度组患儿痰液中VEGF mRNA表达水平依次显著升高，且患儿外周血单个核细胞中及痰液中LncRNA MEG3表达水平与VEGF mRNA表达水平均呈负相关，提示，LncRNA MEG3可能通过调控VEGF水平，促进支气管上皮细胞增殖，影响病毒新毛细支气管炎进展。有研究表明，骨性关节炎患者软骨组织中lncRNA MEG3表达水平明显低于正常软骨组织，与VEGF表达水平呈负相关，与血管生成和骨性关节炎发生过程有关[10]。有研究表明，咳嗽变异性哮喘患儿血清中VEGF高表达，与IL-4、IL-5等炎症因子表达水平成正相关[11]。提示本研究中，LncRNA MEG3可能通过VEGF，调控炎症因子水平，影响病毒性毛细支气管炎发生发展。

本研究结果显示，有过敏史患儿外周血单个核细胞及痰液中LncRNA MEG3表达水平显著低于无过敏史患儿，提示外周血单个核细胞及痰液中LncRNA MEG3表达水平变化可能与病毒性毛细支气管炎患儿是否存在过敏史有关。进一步研究发现，治疗出院后并发哮喘患儿外周血单个核细胞及痰液中LncRNA MEG3表达水平明显低于未并发哮喘患儿，且有过敏史、VEGF高表达、LncRNA MEG3低表达是影响病毒性毛细支气管炎患儿发生不良预后危险因素，提示LncRNA MEG3可能作为病毒性毛细支气管炎生物标志物，影响疾病进展及患儿预后。

综上所述，对照、轻度、中度和重度组患儿外周血单个核细胞和痰液中LncRNA MEG3表达水平依次显著降低，与VEGF表达水平呈负相关，可能通过调控VEGF表达，影响病毒性毛细支气管炎发生发展及患儿预后。但由于本研究方法较为基础，样本量较少，具体机制尚需进一步深入研究。