miR-655-3p通过靶向抑制ZEB1对头颈鳞状细胞癌细胞增殖及侵袭能力的影响

赵 雷, 肖二彬, 梁景卫, 刘会清, 刘丽娜， 田从哲

(1.河北大学附属医院耳鼻咽喉科， 河北 保 定 071000 2.武警河北总队医院耳鼻咽喉科， 河北 石家庄 050081)

MicroRNA(miRNA)是一类长约20～24个核苷酸的微小非编码RNA，通过其“种子区”与靶mRNA(messenger RNA)的3'-UTR(3'-untraslated regions)或开放阅读框以碱基互补配对的方式结合，从而在转录后水平引起靶mRNA的降解或翻译抑制[1]。而某些核型miRNA成熟后被转运至细胞核内，并在转录水平发挥调控作用。研究发现，miRNA可以在肿瘤代谢、癌细胞凋亡、癌细胞干性维持等诸多方面发挥肿瘤调控作用，包括HNSCC的发生发展[2,3]。如miR-205-5p在HNSCC中表达增高，并通过靶向抑制BRCA1和 RAD17的mRNA水平，从而降低DNA损伤修复能力并增加染色体不稳定[4]。既往研究发现，miR-655-3p在视网膜母细胞瘤、食管鳞状细胞癌、非小细胞肺癌等肿瘤中表现出抑癌作用，具有重要临床意义，但目前尚未发现miR-655-3p在HNSCC中的相关研究[5～7]。因此，本研究旨在通过系列实验，初步探索miR-655-3p在HNSCC发生发展中的可能作用机制，为深入探究HNSCC的发病机理提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料:本研究纳入手术治疗的HNSCC患者组织样本(均未接受放化疗)25例，其中男性23例，女性2例；年龄42～67岁，中位年龄56岁；Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期17例；中-高分化18例，低分化7例；13例伴颈部淋巴结转移，12例不伴颈部淋巴结转移。各样本切取癌组织(非坏死瘤体组织)及配对癌旁正常组织(距瘤体边缘0.5cm以上)。样本收集取得患者书面知情同意。本研究取得医院伦理委员会批准。

1.2方 法

1.2.1细胞培养及转染:本研究所采用HNSCC细胞系(FaDu、SCC-9、TU686、TU212)和正常对照细胞系人支气管上皮细胞系(HBE)购自北京北纳创联生物技术研究院，并按细胞系说明书常规培养。细胞系转染(miR-655-3p mimics/NC)按照Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)说明书操作步骤完成。

1.2.2总RNA提取及反转录:按照RNAprep Pure Tissue Kit和RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit(天根，北京)说明书分别提取组织及细胞系总RNA。所提取总RNA质控合格后，按照miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit和FastKing RT Kit(With gDNase)(天根，北京)说明书分别完成miRNA和mRNA反转录。

1.2.3基因相对表达水平检测:各组织样本及细胞系中miR-655-3p、ZEB1、E-cadherin(CDH1)、N-cadherin(CDH2)、Vimentin相对表达水平检测，分别以U6、GAPDH为内参照，按照Quant One Step RT-qPCR Kit (SYBR Green)(天根，北京)说明书通过qRT-PCR仪(安捷伦，美国)完成，相对表达量以2-△△ct计算。相关引物(表1)由上海吉玛制药技术有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.4MTT细胞增殖实验:按照MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit(碧云天，上海)说明书操作步骤，通过酶标仪测定570nm波长附近的吸光度，以检测细胞增殖能力。

1.2.5Transwell实验:细胞转染24h后，制备细胞悬液，每Transwell(8μm)小室(BD，美国)加入4×104个细胞，常规培养24h后，收集、固定并计数穿透小室基底的细胞数(侵袭实验需提前将小室基底包被基质胶)。

1.2.6双荧光素酶报告基因分析:通过生物信息学分析，预测miR-655-3p的可能靶基因ZEB1及其可能结合位点，由上海吉玛制药技术有限公司合成报告载体pmirGLO-ZEB1-3'UTR wild-type(Wt)和pmirGLO-ZEB1-3'UTR mutant-type(Mut)，将双荧光素酶报告基因质粒、miR-655-3p mimics/NC、Wt和Mut按不同分组通过Lipofectamine 2000实现细胞共转染。进一步按照双荧光素酶报告系统Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，美国)说明书操作步骤，完成各组荧光素酶活性检测。

2 结 果

2.1在HNSCC组织及细胞系中miR-655-3p呈低表达:与配对癌旁正常组织中表达水平(3.17±0.20)相比，miR-655-3p在HNSCC癌组织中相对表达水平(2.89±0.17)明显降低(图1A)，差异有统计学意义，P=0.012。为进一步了解miR-655-3p在HNSCC中的表达趋势，通过检索NCBI-GEO DataSets中HNSCC相关miRNA表达谱数据，发现含有miR-655-3p的数据集有GSE31277(GPL9770)、GSE32115(GPL14577)。分析发现，数据集GSE31277中miR-655-3p在HNSCC组织中表达降低(Fold change=0.52，P=0.013)，而数据集GSE32115中miR-655-3p在HNSCC组织中同样低表达(Fold change=0.48)，但差异不显著(P=0.293)(图1B)。与正常对照细胞系HBE中表达水平(0.99±0.03)相比，miR-655-3p在HNSCC细胞系FaDu(0.79±0.02)、SCC-9(0.51±0.02)、TU686(0.78±0.03)、TU212(0.86±0.03)中表达水平降低，P<0.05，且各细胞系表达水平不同(图1C)。而细胞系SCC-9中miR-655-3p表达水平最低，故用于后续功能实验研究。

图1 miR-655-3p在HNSCC中的表达情况

2.2miR-655-3p可抑制细胞系SCC-9的增殖、迁移及侵袭能力:MTT和Transwell实验发现，通过miR-655-3p mimics过表达细胞系SCC-9中miR-655-3p的表达，可明显抑制细胞系SCC-9的体外增殖、迁移及侵袭能力(图2)。

图2 miR-655-3p对HNSCC细胞功能的抑制作用(**P<0.01)

2.3生物信息学预测miR-655-3p可能的靶基因:为探讨miR-655-3p可能的抑癌机制，本研究通过TargetScan、miRDB、miRTarBase三个数据库分别预测miR-655-3p可能的靶基因，并通过韦恩图计算获得三个数据库共同靶基因22个，进一步通过在线数据库GEPIA分析22个靶基因在HNSCC中的表达情况，筛选出在HNSCC中高表达的17个(CNBP、ZEB1、MID1、ADAM10、ELK4、SESN3、SLC35F5、ATAD2、SKI、SPIRE1、CAPRIN2、TMEM64、TGFBR2、CANX、ADM、PTP4A1、KPNA6)，低表达的5个(HIPK3、WEE1、MAGI2、TRPS1、SATB1)。本研究前期实验发现miR-655-3p在HNSCC中低表达，而miRNA可以引起靶mRNA降解，即靶mRNA与miR-655-3p在HNSCC中表达水平呈负相关。因此，本研究着眼于高表达的靶基因。而miRTarBase数据库提示在共同的靶基因中，ZEB1、ADAM10、MAGI2有Luciferase reporter assay、Western blot、qRT-PCR实验支持，但MAGI2在HNSCC中低表达，因此ZEB1、ADAM10作为miR-655-3p的靶基因筛选重点。既往研究发现，ZEB1作为上皮-间充质转化的促进剂，可促进肿瘤恶性表型的进展[8]。因此，本研究选择ZEB1作为miR-655-3p的靶基因进行后续研究。通过qRT-PCR证实ZEB1在HNSCC癌组织中表达水平(2.04±0.79)高于配对癌旁正常组织(1.66±0.69)，差异有统计学意义，P=0.012(图3A)，且ZEB1与miR-655-3p在HNSCC组织中的表达水平呈负相关(R=-0.537，P=0.006)(图3B)。

2.4miR-655-3p靶向调控ZEB1的表达:为进一步探讨miR-655-3p对ZEB1的靶向调控作用，本研究通过qRT-PCR证实，SCC-9细胞系转染miR-655-3p mimics后，ZEB1表达水平(0.60±0.06)显著低于miR-655-3p NC转染后的表达水平(0.98±0.03)，P=0.001(图3C)。为证实miR-655-3p与ZEB1的作用关系，通过TargetScan数据库预测二者的结合位点(图3D)，并构建pmirGLO-ZEB1-3'UTR wild-type(Wt)和pmirGLO-ZEB1-3'UTR mutant-type(Mut)表达载体，通过pmirGLO-ZEB1-3'UTR Wt/Mut和miR-655-3p mimics/NC共转染。双荧光素酶报告基因实验证实，与对照组相比，pmirGLO-ZEB1-3'UTR Wt和miR-655-3p mimics能够显著降低荧光素酶活性(P=0.001)(图3E)。

图3 miR-655-3p靶向ZEB1调控上皮-间充质转化

2.5miR-655-3p能够抑制HNSCC细胞的上皮-间充质转化:考虑miR-655-3p能够靶向调控ZEB1的表达，而ZEB1是上皮-间充质转化的重要促进剂，因此本研究推测miR-655-3p能够抑制上皮-间充质转化进程，而qRT-PCR证实过表达miR-655-3p的表达，能够影响细胞系SCC-9中上皮-间充质转化标志物表达水平的改变(P<0.01)(图3F)。

3 讨 论

HNSCC是世界上第六位高发恶性肿瘤，每年大约有650,000新发病例，并呈上升趋势，其5年生存率大约50%[9]。因此，深入探究HNSCC的发病机制，筛选相关肿瘤标志物或靶向治疗的新靶点，对HNSCC的综合治疗具有重要意义。

研究发现miRNA 可以通过Notch、WNT/β-Catenin、JAK/STAT或PI3/AKT等多种信号通路，参与肿瘤干细胞的干性维持，如自我更新、分化、上皮-间充质转化等多种恶性表型的生物学调控，从而在包括HNSCC在内的多种肿瘤中发挥促癌或抑癌作用[3]。有报道提出，miR-141通过靶向抑制EGFR的表达，可以抑制HNSCC细胞的增殖、迁移能力，并诱导其凋亡，抑制肿瘤细胞肝转移[10]。另有研究发现，miR-205-5p在HNSCC中通过负向调控BRCA1和RAD17 mRNA的表达，抑制DNA损伤修复活性并增加染色体不稳定，从而抑制肿瘤生长[4]。MiRNA在肿瘤，尤其是在HNSCC中的重要作用，促使我们致力于探究HNSCC发生发展中miRNA相关分子机制。

既往研究发现，miR-655能够抑制食管鳞状细胞癌、上皮源性卵巢癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭能力及上皮-间充质转化进程[11]。MiR-655-3p在多种肿瘤中表达降低并体现出一定程度的抑癌作用，提示其生物学作用具有泛癌性，可能参与了多种肿瘤的发生发展过程。因此，本研究推测miR-655-3p可能在HNSCC中异常表达并参与其某种生物学过程，但目前尚未发现miR-655-3p在HNSCC中的相关研究。本研究初步通过qRT-PCR实验证实miR-655-3p在HNSCC癌组织及细胞系中表达降低，提示miR-655-3p在HNSCC的发生发展中可能具有一定的生物学作用，而细胞功能学实验证实miR-655-3p能够抑制HNSCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力，与既往研究中报道miR-655-3p的生物学特性一致。为进一步探讨其作用机制，通过生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验证实，miR-655-3p通过靶向抑制ZEB1 mRNA的表达，抑制HNSCC细胞上皮-间充质转化进程，从而抑制其恶性表型的进展。

综上，本研究初步探讨了miR-655-3p在HNSCC中表达降低，并通过靶向抑制ZEB1的表达，进而抑制HNSCC细胞的增殖、迁移、侵袭能力及上皮-间充质转化进程。本研究进一步丰富了HNSCC中miRNA相关机制研究，为HNSCC的标志物筛选及靶向治疗具有一定的参考意义。