吲哚菁绿荧光显影技术在腹腔镜胆囊手术中的应用

李晓勉，李晶华，王海涛，何跃明，刘志苏，张中林，袁玉峰

(武汉大学中南医院肝胆胰外科，湖北 武汉 430071)

腔镜胆囊切除术(laparoscopic cholecystectomy，LC)作为肝胆外科最为常见的手术，胆管损伤是其最为常见且后果严重的并发症，对病人术后生活质量和生存率有着显著影响，最新文献统计数据显示其发生率为0.4%～0.5%[1-2]。吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)作为一种静脉内注射水溶性染料，因其具有能被肝脏选择性摄取后经胆汁排泄，并与胆汁中黏蛋白成分结合后在近红外光激发下呈现绿色荧光的特性，为血管和胆管结构的荧光可视化提供了可能，目前，ICG的荧光成像技术正迅速应用于肝胆外科手术领域。已有文献[3]初步揭示了ICG荧光显影在胆囊切除手术的应用价值，然而各医疗单位，特别是基层医院，对这一技术在胆道手术中应用，如ICG注射的时机、剂量、给药途径，以及病例选择等方面的认识，仍存在困惑。为此，我们总结了ICG荧光显影技术在LC中的初步应用经验，包括病例选择，ICG给药时机、剂量、途径，显影时间，显影效果，以及对手术的指导意义等，进一步验证该技术在LC中的应用价值。

资料与方法

一、临床资料

纳入武汉大学中南医院肝胆胰外科2018年5月至2019年9月期间诊断为胆囊结石合并急性胆囊炎、慢性萎缩性胆囊炎或残余胆囊等拟行腹腔镜胆囊手术的病人。入组标准：①术前临床及影像学评估预计有胆道结构识别困难、显示不清、操作困难者；②有致胆管损伤风险增高的危险因素者，如再次胆囊或胆管手术、胆囊萎缩、炎症较重长期反复发作、胆囊三角脂肪堆积、结石/炎症等导致与邻近重要管道结构界线不清等。排除标准：年龄大于80岁，肝功能Child-Pugh C级，肾小球滤过率<55 ml/min，怀孕或哺乳期，甲状腺功能亢进，对碘剂或ICG过敏，有全身麻醉禁忌等。共计56例术前评估有致胆管损伤风险增高或于术中发现胆道结构识别困难、操作困难的病人，符合纳入标准，包括男性病人21例和女性病人35例，男女比例为0.6∶1，年龄为(44.38±12.08) 岁(24～63岁)，体质量指数(body mass index，BMI)为(23.98±2.50) kg/m2(20.2～28.1 kg/m2)，Child-Pugh 分级A级55例、B级1例。

其中48例拟施行ICG荧光显影引导下单纯LC的病人被随机分入0.5 mg、1 mg、5 mg、10 mg四组不同剂量组(每组各12例)，于气腹建立后经外周静脉注射ICG。四组病人的年龄、性别、BMI、总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间(PT)延长等临床资料差异均无统计学意义(均P>0.05)，详见表1，且Child-Pugh评级均为A级。另8例病人于术中经初步解剖目标胆管结构后仍不能很好对目标胆管进行识别，于术中经胆囊、胆囊颈管及肝内胆管注射ICG。本研究经医院伦理委员会批准，所有病人均于术前签署知情同意书。

二、ICG荧光材料及操作材料

1.荧光手术系统 采用Novadaq的Pinpoint腹腔镜荧光成像系统，该系统可呈现LED可见光和近红外激光双光源的内窥镜影像，与荧光显影剂ICG配合使用可提供高清白光、黑白荧光、绿色荧光3种成像模式。

2.注射用ICG ICG(25 mg/安瓿，带10 ml灭菌注射用水)由卫材(辽宁)制药有限公司生产。

3.ICG注射的方式、剂量及时间 ①ICG排泄性胆道显影：拟施行单纯腹腔镜胆囊切除病人按注射剂量随机分为0.5 mg、1 mg、5 mg、10 mg四组，气腹建立后经外周静脉注射ICG(以自带10 ml灭菌注射用水稀释至2.5 mg/ml作为“工作浓度”取用)。②术中胆道注射ICG显影：前述“工作浓度”ICG以生理盐水稀释100倍(0.025 mg/ml)，根据胆管容积取适量(10～50 ml)以细针穿刺胆囊底部/胆囊颈管注射ICG，或在腹腔镜超声引导下以20G PTC-B针(日本八光)经肝穿刺肝内胆管注射，注射时回抽胆汁使ICG溶液与胆汁充分融合后再次注入胆囊或胆囊颈管或肝内胆管。

三、手术方式及荧光效果评价

根据病人疾病类型、局部炎症状态及病人个体情况，合理确定手术方式，包括单纯腹腔镜胆囊或残余胆囊切除、胆囊切除+术中胆道镜和(或)十二指肠镜胆管取石等。

ICG荧光效果评价采取术中主刀医师和助手医师共同识别目标胆管的方式，记录自注射开始至判定为“显影成功”的时间。目标胆管清晰荧光，与毗邻组织结构有良好的分界，能够协助完成关键目标结构的识别和鉴别，用以引导完成手术，降低或避免胆管或邻近重要结构的损伤；或目标能够显影，亮度或对比度虽然稍差，但是仍然能基本完成目标识别、鉴别与引导，达到手术目的，均判定为“显影成功”。手术全过程中目标胆管未能实现荧光，或者荧光过强或过弱、与重要目标结构失去对比度，无法完成对手术目标的引导，判定为“显影失败”。对于判定为“显影失败”的病人，不统计显影时间。

荧光强度评价方式为术中荧光腹腔镜下判定“显影成功”时，距目标胆管2 cm处对其进行摄像，术后在目标胆管上随机选取3点应用Image J软件测定该点荧光强度。对于“显影失败”的病人，仍在目标胆管完成解剖后随机取3点测定荧光强度并计入统计。

四、统计学方法

采用SPSS(26.0版)统计软件对病人基线资料及目标胆管显影时间、荧光强度进行统计学分析，关于目标胆管显影时间、荧光强度的组间比较使用one-way Anova检验，当P<0.05时则认为差异存在统计学意义。

结 果

一、病人术中及术后资料

56例病人中，54例施行单纯腹腔镜胆囊或残余胆囊切除术，2例施行LC +术中胆道镜和(或)十二指肠镜胆管取石，全部病人均顺利实施手术，无胆道损伤、胆漏及其他并发症发生。术后病理证实胆囊结石伴急性胆囊炎43例，慢性萎缩性胆囊炎7例，残余胆囊切除3例，胆囊结石并胆总管结石2例，Mirizzi综合征1例。手术时间为(43±17) min(40～97 min)，术中出血量为(50±26) ml (30～120 ml)，术后住院时间为(3±1) d(2～5 d)。

二、ICG注射剂量、方式与时间分析

48例病人拟施行ICG引导单纯LC病人，随机分入0.5 mg、1 mg、5 mg、10 mg四组，除0.5 mg组2例病人直至手术结束时目标胆管仍未显影外，其余病人均在术中观察到肝外胆管显影。46例显影成功的病人，最快7 min即可观察到胆总管显影(图1)，总显影时间为(35.37±15.43) min(7～75 min)，0.5 mg组显影时间为(53.60±13.73) min(36～75 min)，1 mg组显影时间为(42.83±7.80) min(31～52 min)，5 mg组显影时间为(24.92±6.95) min(7～34 min)，10 mg组显影时间为(23.17±8.11) min(9～32 min)。0.5 mg组显影时间长于另外三组，差异均具有统计学意义(与1 mg组比较P=0.01；与5 mg组比较P<0.001；与10 mg组比较P<0.001)。1 mg组显影时间长于5 mg组及10 mg组，差异均具有统计学意义(与5 mg组比较P<0.001，与10 mg组比较P<0.001)。5 mg组与10 mg组显影时间比较差异无统计学意义(P=0.647)。46例病人术前经外周静脉注射ICG的剂量与自注射至术中目标胆管显影时间的关系见图2。

术后使用Image J软件测定目标胆管的荧光强度，2例判定“显影失败”的病例，在肝门部解剖结构清晰后仍对目标胆管随机取3点并测取该点的荧光强度。48例病人共测定144点。总荧光强度为(26.25±10.05) AU(2.78～44.73 AU)， 0.5 mg组荧光强度为(13.03±4.46) AU(2.78～20.41 AU)， 1 mg组荧光强度为(28.38±7.31) AU(18.42～42.75 AU)， 5 mg组荧光强度为(30.44±6.91) AU(20.46～42.35 AU)， 10 mg组荧光强度为(33.16±6.34) AU(24.03～44.73 AU)。0.5 mg组荧光强度弱于另外三组，差异均具有统计学意义(均P<0.001)。1 mg组荧光强度与5 mg组差异无统计学意义(P=0.17),弱于10 mg组，差异具有统计学意义(P=0.002)。5 mg组与10 mg组荧光强度比较差异无统计学意义(P=0.71)。48例病人气腹建立后经外周静脉注射不同剂量ICG与术后测定目标胆管荧光强度的关系见图3。

8例病人经胆囊颈管或胆总管或肝内胆管注射0.025 mg/L的稀释ICG溶液显影肝外胆管，除1例腹腔镜下肝穿刺经肝内胆管注射病人目标胆管显影失败外，余7例目标胆管均立即发出荧光并通过胆囊颈管或肝总管引起整个肝外导管显影(7/8，87.5%)。

三、ICG荧光肝外胆管成像对腹腔镜胆囊切除手术的引导作用

本研究共有7例萎缩性胆囊及3例残余胆囊病人，术中经初步解剖胆囊三角后结构仍然显示不清，肝门部血管、胆管结构无法分辨，于气腹建立后经外周静脉注射不同剂量的ICG，或于术中以0.025 mg/ml的浓度根据目标胆管容积注射ICG，肝外胆管均获得良好对比度。图4示1例萎缩性胆囊病人于气腹建立后经外周静脉注射1 mg ICG，33 min后胆囊颈管开始显影，43 min时目标胆管与肝脏背景对比明显，在ICG荧光引导下完成胆囊颈管及肝总管分离。

讨 论

胆管损伤造成的胆漏、胆管梗阻以及修复后形成的胆管狭窄等严重并发症，会使得病人反复手术、致残甚至死亡。Stewart[4]统计近半数肝胆外科医师在职业生涯中有过造成1次以上胆管损伤的执业经历，且医源性胆管损伤主要源自LC中损伤胆管，因此这是每一位肝胆外科医生都需要正视的问题。施行胆囊切除、胆道探查等手术的前提是辨识胆总管，在出现炎症粘连、解剖变异、二次手术等情况时，胆囊三角、肝门部的解剖结构往往难以分辨[4-5]，增加了损伤胆总管或肝总管的概率。基于ICG的荧光特性，使用荧光腹腔镜可对胆管进行实时显影以避免胆道损伤[6-7]，体现了ICG荧光成像应用于胆囊切除手术的重要性。因此，本研究中对入组病例进行了特定选择，纳入术前评估(或术中发现证实)，胆道结构识别困难、操作困难、或有其他任何致胆管损伤风险增高的危险因素者，总结本中心在ICG在LC中的应用要点以及探讨该技术对于减少术后并发症的意义。

ICG引导的荧光胆管成像的方式可分为：排泄性胆道显影和胆管直接注射显影两种方法。基于ICG药代动力学特点及亲肝特性，ICG经外周静脉注射数分钟之内即可在肝脏显著蓄积，荧光腹腔镜下一般可在2～5 min之内观测到强烈的肝脏荧光。随着ICG向胆汁中排泄并和胆汁内黏蛋白结合，进而随胆汁排泄进入肝外胆管，在特定光源激发下即可形成肝外胆管荧光显影。既往文献报道，根据病人肝细胞代谢ICG快慢的不同，胆汁中的浓度峰值发生在注射后0.5～2 h之间[8-9]，因而推荐ICG注射的时间应为术前0.5～1 h。但是在本组研究中，0.5 mg组的显影时间较另外3组长，差异有统计学意义，且不能保证绝对成功(成功率为83.3%，10/12)。对于另外3组注射后30 min左右肝外胆管即可满意显影，因此建议在采取>1 mg剂量时，至少应在术前30 min经外周静脉注射ICG，以获得目标胆管良好显影。在需要对胆囊动脉显影的情况下，可给予额外的ICG注射，而值得注意的是，在手术期间静脉内再次给药将导致肝脏发出强烈荧光，故再次注射应在阐明胆管解剖结构后进行。要实现以引导手术为目的、满意的胆管荧光显影，除了注射时间外，ICG剂量是一个重要的考虑因素，然而关于胆管显影中ICG外周静脉应用的剂量，文献报道差异很大[3,10]。ICG剂量过大会导致肝门区组织浸染，特别是对于胆囊颈管-肝管分支较高、或者肝门区水肿粘连严重的病人，广泛的荧光浸染会导致导航失败；而如果用药剂量过小，ICG在胆汁中蓄积需要等待的时间会显著延长，特别是对于那些肝功能受损的病人，等待时间会更长。当使用0.5 mg剂量静脉注射时，除外2例未显影病例，本研究中我们观察到最长的等待时间是75 min，对于LC这种小规模手术而言，人为地延长了手术时间、增加了时间经济成本。基于本中心进行ICG荧光引导腹腔镜肝切除的经验[11]，我们尝试了0.5 mg、1 mg、5 mg及10 mg四组不同剂量的显影效果，发现1 mg组与5 mg组、5 mg组与10 mg组在判定为“显影成功”时的荧光强度差异无统计学意义，考虑到前述的大剂量浸染问题，因此建议，对于绝大多数病人而言，1 mg的静脉使用剂量应是合理的，既能实现满意的目标管道显影，又可避免肝门区浸染、等待时间延长。因ICG荧光的组织穿透能力约5～10 mm[12-13]，对于肝功能明显受损、肥胖或肝十二指肠韧带水肿严重，导致显影不满意的病人，可适度增加ICG剂量。

胆道直接注射显影者，因将ICG直接注射入胆道管腔内而即时显影，需要考虑显影剂浓度及容积对显影效果、时间的影响。与黏蛋白结合的ICG荧光浓度约为0.25 mg/ml，而ICG在较高浓度下对近红外光的吸收能力降低，所以为了胆管内注射ICG后获得胆管的清晰荧光图像，可将ICG溶液稀释到0.025 mg/ml用于显影[13-14]。故本研究采取浓度为0.025 mg/ml，根据胆管容积酌情取用，即刻显影。ICG胆管注射的途径，有经肝内、外胆管，胆囊及胆囊颈管，术者可以根据病人具体情况合理选择，考虑管腔大小、长度及容积效应，只要方法得当，均可以实现目标胆管的显影。腹腔镜超声引导下经皮经肝细针穿刺，经肝内胆管注射ICG显影亦行之有效。需注意的是，在拔除穿刺针时对穿刺点应及时电灼，防止渗漏污染手术视野。该操作对术者有一定的技术要求，术者可根据自身情况选用。虽有研究者尝试甚至推崇经胆囊穿刺注射ICG[15-16]，但根据本中心实际经验，因胆囊质软且游离，容积较大，该方法易渗漏掩盖手术视野，且一旦出现渗漏无法通过抽吸或纱布擦拭使其立即清除，因此并不推荐作为优先选择的手段。

相比于传统的X线引导术中胆管造影(IOC)，ICG引导荧光胆道显影具有如下优势：首先，该技术通过术前静脉注射或术中直接向胆管/胆囊注射ICG，术者即可根据术中需要获取胆道的荧光图像，相比于IOC在插入用于注入造影剂的套管时本身即可能引起胆管损伤，其是一种相对无创的措施；其次，实时显影，成像质量清晰、分辨率高，可有效缩短病人手术时间；第三，安全性高，不涉及辐射，且ICG不良反应少，严重不良反应发生率和致死率分别为0.05%和0.000 3%[17]。

总之，本中心在既往应用ICG荧光显影技术行腹腔镜肝切除的基础之上，对于该技术在复杂胆道手术中的应用进行研究，发现合理选择ICG的注射剂量、途径以及时间，有利于提高复杂LC的安全性，减少意外胆管损伤。