FAP-α和SDF-1预测新辅助化疗结直肠癌病人预后的研究

赵凌昆,王 新,赵云波

(1.佳木斯大学临床医学院；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)作为我国常见消化道恶性肿瘤之一，其发病率及病死率均呈现逐年上升趋势[1]，大多数患者被确诊时已为病程中晚期，出现淋巴及远处转移。随着医学的发展，治疗方式由单一手术切除转为新辅助化疗联合手术治疗为主。新辅助化疗(primary chemotherapy,PcT)是指在恶性肿瘤根治性手术或者放疗前进行几个疗程的联合化疗，缩小肿瘤体积，降低肿瘤分期，预防术后复发，对术后辅助化疗药物的选择有一定的指导意义。

成纤维细胞活化蛋白-α(fibroblast activation protein-α,FAP-α)是肿瘤相关成纤维细胞(Tumor-associaated fibroblast,TAF)的特异性标志物，对于肿瘤细胞的生长、侵袭及转移等方面作用显著[2]。基质细胞活化因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)属于趋化因子蛋白家族，对淋巴细胞有强烈的趋化作用。FAP-α及SDF-1蛋白在结直肠癌病人中研究相对较少，尤其在分子水平上对实施新辅助化疗的结直肠癌病人预后的研究更是少有报道。故本研究旨在观察结直肠癌病人FAP-α及SDF-1蛋白的表达以及与新辅助化疗后结直肠癌病人临床病理特征、预后之间的关系，为临床医师对病人预后评估提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料标本来源于2010年1月至2012年12月间于佳木斯大学附属第一医院行术前新辅助化疗，并进行外科手术治疗且术前临床TNM分期为Ⅱ期及Ⅲ期结直肠癌患者80例(采取第七版UICC发布的结/直肠癌TNM分期)。另选取20例健康志愿者通过电子内窥肠镜收集正常的大肠黏膜组织作为对照。

纳入标准:(1)就诊于我院行新辅助化疗(术前化疗方案：5-FU方案，4周期，剂量600mg/m2，d1；维持量400 mg/m2，d2～6。)并行根治性外科手术治疗者；(2)术前临床TNM分期为Ⅱ期及Ⅲ期的结直肠腺癌；(3)术后标本均福尔马林固定，石蜡包埋备用，术后所有病人均签署同意书；(4)临床资料及随访资料完整(术后65例随访5年，15例失访或资料不全)。

排除标准:(1)术前未接受新辅助化疗；(2)同时性多源癌或合并有其他癌症病史；(3)姑息性切除或局部切除者；(4)非肿瘤相关性死亡。

所有肿瘤组织及正常结直肠组织经2位资深病理科医师先行HE染色观察，诊断无误后进行免疫组化检测。

1.2 方法将上述石蜡包埋的组织制作为4μm厚的切片，HE染色，光镜观察；采用链霉素-生物素免疫组织化学技术，检测FAP-α及SDF-1在结直肠癌及正常结直肠黏膜组织中的表达。主要试剂为FAP-α兔抗人单克隆抗体及兔抗人SDF-1单克隆体抗(购自北京博奥森生物技术有限公司)。具体操作过程按试剂盒说明书进行。

1.3 免疫组化结果判定用PBS代替一抗作为阴性对照,细胞浆和(或)细胞膜呈棕黄颗粒为SDF-1、FAP-α阳性表达；采用半定量计分法，根据阳性细胞的染色强度及阳性细胞率进行综合评分:0分为无色或无细胞染色；1分为浅黄色或阳性细胞≤25%；2分为棕黄色或阳性细胞26%～50%；3分为棕褐色或阳性细胞>50%；两项分数相加为最后总得分，0～2分为阴性，3～6分为阳性。

1.4 术后随访通过门诊复查、电话等方式进行随访，术后前2年每3个月随访1次；第3～5年每6个月随访1次。复查项目包括询问病情、一般查体、血肿瘤标志物、超声检查、CT及电子肠镜等，记录患者随访档案，随访时间截至术后60个月。

1.5 统计学方法本实验所有数据应用SPSS 25.0统计软件分析包分析处理,以频数表示计数资料，以“均数±标准差”表示计量资料,无序分类资料组间差异比较采用卡方检验，分析FAP-α及SDF-1与相关临床病理特征的关系，阳性率间相关性分析采用Spearman相关分析检验；采用Kaplan-Meier法分析生存情况,以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 FAP-α的表达情况及其与临床病理特征的关系免疫组织化学法检测FAP-α蛋白的阳性表达主要位于胞浆及胞膜内，在结直肠癌中阳性表达率为55%(44/80)，见图1、图2；正常组织中阳性表达率为25% (5/20)，两组间差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1 。在结直肠癌组中，FAP-α蛋白的表达与患者的淋巴结转移、肿瘤分期及肿瘤大小有关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、肿瘤部位及分化程度无关(P>0.05)，见表2。

图1 FAP-α在结直肠癌组织中的阴性表达(×100)

图2 FAP-α在结直肠癌组织中的阳性表达(×100)

表1 FAP-α在结直肠癌及正常组织的表达情况

nFAP-α+-χ2P正常黏膜205155.7620.016肿瘤组织804436

表2 FAP-α的表达情况及其与临床病理特征的关系

2.2 SDF-1的表达情况及其与临床病理特征的关系免疫组织化学法检测SDF-1蛋白的阳性表达位于细胞浆内，在结直肠癌中阳性表达率为57.5%(46/80)，见(图3、图4)；正常组织中阳性表达率为30%(6/20)，两组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表3 。在结直肠癌组中，SDF-1蛋白的表达与患者的淋巴结转移、肿瘤分期及肿瘤大小有关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、肿瘤部位及分化程度无关(P>0.05)，见表4。

图3 SDF-1在结直肠癌组织中的阴性表达(×200)

图4 SDF-1在结直肠癌组织中的阳性表达(×200)

表3 SDF-1在结直肠癌及正常组织的表达情况

nSDF-1+-χ2P正常黏膜20614肿瘤组织8046344.8480.028

表4 SDF-1的表达情况及其与临床病理特征的关系

2.3 FAP-α和SDF-1蛋白表达之间的相关性分析应用SPSS软件中spearman秩相关系数分析计算，结果示FAP-α及SDF-1之间的阳性表达有一定的正相关趋势(r=0.8，P=0.2，P>0.05)，但不具有统计学意义，见表5。

表5 FAP-α表达阳性结直肠腺癌中 SDF-1的表达情况及相关性分析

2.4 FAP-α蛋白表达阳性组与阴性组生存差异分析Kaplan-Meier生存曲线显示，FAP-α蛋白表达阳性组结直肠癌患者总生存时间低FAP-α蛋白表达阴性组，Log Rank(Mantel-Cox)结果示，χ2=4.218，P=0.04，P<0.05，差异具有统计学意义(见图5)。

图5 FAP-α蛋白表达阳性组与阴性组生存曲线

2.5 SDF-1蛋白表达阳性组与阴性组生存差异分析Kaplan-Meier生存曲线显示，SDF-1蛋白表达阳性组结直肠癌患者总生存时间低于SDF-1蛋白表达阴性组，Log Rank(Mantel-Cox)结果示，χ2=6.576，P=0.01，P<0.05，差异具有统计学意义(见图6)。

图6 SDF-1蛋白表达阳性组与阴性组生存曲线

3 讨论

FAP-α通过降解肿瘤组织细胞外基质成分对肿瘤细胞的侵袭和转移起着重要的作用。现国际上对于其在恶性肿瘤细胞中的作用尚不能达成统一观点，但已知其活性与许多恶性转化细胞的侵袭行为密切相关[2]。Akinboye Emmanuel S等[3]研究显示FAP和二肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPPIV)以复合物形式定位于胶原纤维、成纤维细胞表面,与明胶结合并将其溶解，促进细胞迁移。Henry L R[4]等研究指出，在结肠癌中，肿瘤的分期及肿瘤体积与FAP蛋白的表达呈现正相关性，提示FAP的表达对肿瘤的发展具有重要作用，其高表达的肿瘤肿瘤细胞更易扩散，因此FAP亦曾被认为是早期肿瘤潜在的治疗靶点。本次实验结果为FAP-α在结直肠癌组织中的表达明显高于正常结直肠粘膜组织，因此，FAP-α的高表达可能标志着肿瘤的发生；在FAP-α蛋白表达与临床病理特征的关系中发现，FAP-α蛋白表达阳性与患者肿瘤大小、淋巴结转移及分期情况呈现正相关性，说明FAP-α蛋白过表达对于结直肠癌浸润、转移及分期情况可能有着一定的指向作用；FAP-α蛋白表达阳性组结直肠癌患者总生存时间低FAP-α蛋白表达阴性组，对于新辅助化疗患者术后生存时间的影响差异具有统计学意义，说明FAP-α蛋白可能影响着患者的预后情况。这与Cohen SJ[5]等研究FAP在胰腺癌中高表达且预示患者不良预后结论相同。

SDF-1是由骨髓基质细胞、相关的间皮细胞和上皮细胞分泌的一种趋化蛋白，CXC族趋化因子受体 4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)是目前已知SDF-1的唯一受体，两者特异性结合后构成的SDF-1/CXCR4生物学轴广泛参与体内多种病理、生理过程[6-7]。近几年研究证实SDF-1/CXCR4轴与肿瘤细胞增殖及肿瘤浸润和定向迁移等有关[8-9]。Kryczek等[10]研究表明，CXCR4/SDF-1的相互作用可调节肿瘤细胞内肌动蛋白的合成与重排，实现调控肿瘤细胞的运动性[11]，协助肿瘤细胞的侵袭与转移。本次实验结果，SDF-1蛋白在结直肠癌组织中的表达明显高于正常结直肠粘膜组织，表明SDF-1蛋白高表达可能提示着肿瘤的发生；在SDF-1蛋白表达与临床病理特征的关系中发现，SDF-1蛋白表达阳性与患者肿瘤大小、分期情况及淋巴结转移呈正相关，说明其高表达可能对于结直肠癌浸润、转移及临床分期有一定的相关性；SDF-1蛋白表达阳性组结直肠癌患者总生存

时间低SDF-1蛋白表达阴性组，对于新辅助化疗患者术后生存时间的影响差异具有统计学意义，也说明SDF-1蛋白可用来评估患者的不良预后。

国外Saigusa[12]研究认为，FAP-α和SDF-1表达于肿瘤相关成纤维细胞(TAF)，二者的表达参与肿瘤的再生长和复发，故在TAF中对FAP-α和SDF-1的控制可以有效的防止手术前进行放化疗的结直肠癌患者的远处复发。本研究结果显示，FAP-α和SDF-1两者阳性表达之间仅有一定的正相关趋势(P>0.05)，但不具有统计学意义，说明对于新辅助化疗患者预后无显著影响。另本研究对生存时间研究结果显示，FAP-α和SDF-1蛋白表达阳性组结直肠癌患者总生存时间低于阴性表达组，差异具有统计学意义，表明FAP-α和SDF-1蛋白表达阳性是新辅助化疗结直肠癌病人不良预后的预测因子。