多肽N端修饰方法研究进展

廖秀飞，姜 和，苏春丽，廖洪利，万阳裕

(1.成都医学院，四川 成都 610500；2.四川科伦药业股份有限公司，四川 成都 610071)

多肽作为生物体内调节各种细胞功能的活性物质，因其相对于小分子化学药物有一定优势，已经成为新药研究的一个重要方向。但由于稳定性差等原因，大大限制了其应用，而通过对多肽进行结构修饰，可以改善其理化性质，进而提高稳定性，使其拥有更高的生物活性。修饰后的多肽具有更好的脂水分配系数，易于透膜吸收。研究[1-4]表明，修饰后的多肽可以明显减小药物的毒副作用，延长半衰期，提高药物疗效。

常见的多肽修饰有：磷酸化[5]，是一种翻译后修饰方式，常见的磷酸化目标是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；糖基化[6]，参与生物发育、代谢等重要生命过程，比如蛋白质N-糖基化修饰；环化[7]，多肽的环化分为头尾相连式、侧链与终端连接、侧链与侧链连接，其侧链一般通过二硫桥进行连接，是多肽提高稳定性的常用方法。作者重点介绍了化学合成中多肽N端的修饰方法，为相关研究提供参考。

1 常用多肽N端修饰方法

1.1 乙酰化

乙酰化是多肽合成中最常用的N端修饰方法，一般采用醋酐对N端进行酰化保护，避免多肽N端氨基不稳定而被氧化。

Yun等[8]研究血管内皮生长因子(VEGF)受体2拮抗剂四肽Arg-Leu-Tyr-Glu(RLYE)被不耐热血清因子降解(图1)时发现，由于氨基肽酶B和N的降解，使得RLYE在血清中的半衰期较短(1.2 h)。为了提高RLYE的稳定性和效力，设计了N端乙酰化RLYE(Ac-RLYE)，与原始母体肽RLYE相比，Ac-RLYE在血清中具有8.8 h的稳定半衰期，Ac-RLYE对血管内皮生长因子A(VEGF-A)诱导的内皮细胞迁移的IC50值从母体肽的89.1 pmol·L-1降至约37.1 pmol·L-1；并且使用小鼠异种移植肿瘤模型，证明了Ac-RLYE比RLYE在抑制肿瘤血管生成和生长、增强内皮细胞连接和肿瘤血管的周细胞覆盖、改善血管完整性和正常化以及阻止巨噬细胞浸润等方面更有效。

(a)RLYE的化学结构 (b)RLYE与磷酸盐缓冲液(PBS)或健康人血清(serum)在37 ℃孵育不同时间后的浓度曲线。反应混合物通过反相高效液相色谱法分级，肽浓度通过220 nm处吸光度作为保留值的函数积分来分析(n=3)。内插图是RLYE在健康人血清中孵育不同时间的典型HPLC图谱 (c)健康人血清在不同温度下预热10 min，然后与RLYE在37 ℃孵育2 h的HPLC图谱

图1 RLYE被不耐热血清因子降解曲线
Fig.1 Degradation curve of RLYE by heat-labile serum factor

1.2 PEG(聚乙二醇)修饰

PEG是一种中性、无毒、具有独特理化性质和良好生物相容性的化学物质，被FDA批准可作为体内注射用药。在多肽合成中常使用PEG对N端进行修饰[9]，经PEG修饰过的蛋白质药物[10-11]具有更强的生物活性。PEG修饰的脂质体[12]对肿瘤有更强的被动靶向作用、更长的半衰期、较低的最大血药浓度，由于其血药浓度波动较小，毒性减弱，溶解性提高，从而提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用。

Wu等[13]研究用于治疗身材矮小、肾衰竭和特纳氏综合症儿童的人类生长激素(hGH)时发现，hGH的临床应用受到其血浆半衰期短和生物利用度低的困扰，PEG修饰和与人血清白蛋白(HSA)结合是延长hGH血浆半衰期的两种最有效方法，PEG和HSA的空间屏蔽作用会大大降低hGH的生物活性，这与药代动力学相反。以PEG(3.5 kDa或10 kDa)为连接基，通过PEG-十六烷(HD)对hGH进行N端修饰，合理设计制备了具有明显改善药理作用的长效hGH-PEG-HD(图2)。PEG修饰和与十六烷结合的HSA可以增加流体动力学体积并降低hGH的免疫原性，从而显著增加hGH的pK值。

1.3 荧光试剂修饰

荧光试剂是在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随环境(极性、折射率、黏度等)的改变而灵敏改变的一类荧光性分子，一般用于荧光免疫法中抗原或抗体的标记，还可用作荧光探针[14]。在多肽合成中使用荧光试剂对N端进行修饰，比如异硫氰酸荧光素(FITC)，使其具有荧光特性，可用于生物体内活性物质或者药物分布的标记。

内皮细胞表达的血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)是动脉粥样硬化斑块的重要标志。Xu等[15]研究了一种新型的磁性介孔硅纳米粒子，该纳米粒子能够将药物递送并靶向动脉粥样硬化斑块，以此来诊断和预防动脉粥样硬化。使用掺入到Fe3O4@SiO2中的FITC和VHPKQHR肽构建纳米颗粒FITC-VHP-Fe3O4@SiO2，该纳米颗粒在体外和体内均表现出良好的形态特征、优异的靶向能力、低毒性和良好的生物相容性。体内实验表明，FITC-VHP-Fe3O4@SiO2是磁共振成像(MRI)的优异造影剂，可用于诊断动脉粥样硬化斑块。

图2 hGH-PEG3.5-HD和hGH-PEG10-HD的合成示意图Fig.2 Synthetic diagram of hGH-PEG3.5-HD and hGH-PEG10-HD

1.4 多肽N端亲水性基团修饰

多肽的水溶性大小在纯化时非常重要。在多肽纯化过程中，粗品的溶解需要低比例的有机相以获得更适宜的水相与有机相浓度梯度范围。对于疏水性较强的多肽，水溶性较差就会影响纯化效果。Chandrashekar等[16]采用连接咪唑的吡喃葡萄糖氧羰基和吡喃半乳糖氧羰基在一定条件下与目标肽VVEKFLKRAE反应，不仅修饰多肽N端，还与多肽侧链氨基进行反应(图3)。由于碳水化合物具有多个亲水基团，可提高目标肽的水溶性，因此利用碳水化合物作为保护基团时，后续反应还可以在含水条件下进行。

图3 多肽N端亲水性基团修饰示意图Fig.3 Schematic diagram of N-terminal hydrophilic group modification of polypeptides

1.5 NCL、EPL连接反应

NCL连接反应又叫作自然化学连接反应[17]，是用C末端具有硫酯的肽和N末端为半胱氨酸的肽，在中性常温条件进行反应。该方法利用多肽本身的官能团，延长肽链合成的长度，提高产率，反应机理是硫-氮酰基转移。基于NCL连接反应，Flavell等[18]开发了EPL连接反应(图4)，它是一种半合成技术，其中由内含肽融合蛋白硫解产生的重组蛋白硫酯与具有N末端半胱氨酸的合成或重组肽反应形成天然肽键。EPL与NCL的主要区别在于重组表达的蛋白质比多肽分子量更大，结构更复杂，硫酯与多肽的融合是通过重组蛋白剪接过程实现的，被广泛用于生物物理探针的结合以及非天然氨基酸和蛋白质翻译后修饰。

2 其它多肽N端修饰实例

2.1 2-氨基辛酸修饰抗菌肽AMP

脂肪酸的N端修饰有一定的限制，需要使用其它物质对多肽进行连接，过程较为复杂。Almahboub等[19]研究了一种脂肪酸——2-氨基辛酸(2-AOA)，使用来源于紫黄杆菌的转氨酶，其转化效率为52%～80%；2-氨基辛酸分别与乳铁蛋白肽B衍生的抗菌肽的C端和N端结合，可将抗菌肽AMP(序列：RRWQWRMKK)的抗菌活性提高16倍以上；C末端修饰肽的最小抑制浓度总是低于N末端结合肽的，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等有较好的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，为2-氨基辛酸用于多肽N端修饰和提高抗菌肽的活性提供了研究基础。

图4 EPL连接反应示意图Fig.4 Schematic diagram of EPL ligation reaction

2.2 丁烯酶1介导多肽N端修饰

Hemu等[20]发现天冬酰胺内蛋白酶(AEP)家族的半胱氨酸蛋白酶——丁烯酶1可以催化天冬酰胺与半胱氨酸形成硫酯中间体，通过N端胺的亲核进攻发生硫-氮酰基转移，从而形成新的肽键(图5)。丁烯酶1是修饰肽和蛋白质的有效通用工具，可使用丁烯酶1进行位点特异性肽和蛋白质连接、N末端标记、硫酯的制备和树枝状大分子的生物偶联。

特征识别信号NHV占据了S1-S1′-S2′空穴结构;R、R1和R2分别代表P2、P1″和P2″位残基的氨基酸侧链

2.3 N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸的合成

Burov等[21]用Wang聚合物的α-胍基葡萄糖酸环化，再用三氟乙酸进行切割，可以得到N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸(图6)，为N-脒基-焦谷氨酸残基用于合成短肽打下基础。

2.4 N-terminal caps

图6 N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸的合成Fig.6 Synthesis of N-amidino-pyroglutamyl-phenylalanine

Juhl等[22]研究发现了一些N-terminal caps结构(图7)。Apelin-APJ信号通路与高血压、心血管疾病、免疫以及神经系统有关，但是Apelin peptide代谢稳定性低、半衰期短，经N-terminal caps修饰后可以提高Apelin peptide的稳定性，促进药物开发和体内研究。

图7 用作五元环和六元环的N-terminal capsFig.7 N-terminal caps used in five or six membered rings

3 展望

多肽固相合成法的成功开发与应用为多肽的化学合成带来了革命性的突破，大大提高了多肽的合成效率。目前，针对多肽结构修饰的方法逐渐丰富，人们可根据不同目的选择适宜的修饰方法，其中小分子保护基团的研究已经较为成熟，Fmoc用于氨基酸的保护也普遍适用，但是对于亲水性保护基团的研究仍显不足，可以考虑从其它碳水化合物入手，如将六元环的吡喃糖换成五元环的呋喃糖，或者选用其它杂环替换咪唑基团。此外，多肽的储存条件较为严苛，须低温冷链运输保存。开发提高多肽稳定性的修饰方法是一个值得研究的领域。