构建与鉴定人源 ITPKB 基因腺病毒载体

傅海寿 蔡鹏威

福建省立金山医院检验科，福建省福州市 350008

肌醇1,4,5-三磷酸3-激酶(The Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase，ITPKs)是能催化Ins(1,4,5)P3 (IP3) 生成Ins(1,3,4,5)P4 (IP4)的蛋白酶，属于肌醇多磷酸激酶(IPK)家族，在人类有ITPKA、ITPKB、ITPKC三种亚型[1-2]。其中ITPKA主要表达在前脑、浦肯野神经元及睾丸；ITPKB在脑及其他组织中广泛表达，主要参与免疫系统的调节，在淋巴细胞、中性粒细胞起作用；ITPKC在大部分组织中均有表达，可能与川崎病及主动脉瘤有关[1，3-4]。近年研究发现局麻药毒性反应与细胞内钙离子超载有关[4]。ITPKB对细胞内钙离子的调控最敏感[5]，故设计制作人源 ITPKB 基因腺病毒载体可能为局麻药毒性的基因治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 HEK293细胞、DH5α感受态细胞购于吉凯基因生物公司；ITPKB基因及质粒由维真生物公司包装合成；高糖培养基(DMEM)购于Gibico；胎牛血清购于Gibico；DNA限制性内切酶ASISI/NotI、T4DNA连接酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNDP)、DNA marker、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、q-PCR试剂盒均购于Takara公司；PCR引物由Thermofisher公司合成；转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购于上海广瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成：根据 Genbank查询的结果,全基因合成人源ITPKB基因，目的基因前都加kozak序列GCCACC，C端添加标签：flag，上游引物为5’-AGGACACGCAGGGAGTTTC-3’，下游引物为5’-TGGTAGGCAGGTACGAAGGG-3’，分别在上游引物和下游引物的5’端加入ASISI和NotI酶切位点。

1.2.2 人源ITPKB基因的获取：聚合酶链反应(PCR)扩增合成的ITPKB基因，ITPKB基因全长为2 841bp。反应条件设置95℃ 预变性15s，60℃退火 15s，72℃延伸15s， 40个循环。PCR反应产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳分析并进行胶回收。

1.2.3 腺病毒穿梭载体pADM-ITPKB-FLAG-GFP的构建：将步骤1.2.2胶回收的扩增产物与pAdM-FH-GFP质粒混合，经过限制性内切酶ASISI/NotI双酶切，37℃，3h反应后行凝胶电泳鉴定。回收目的条带的凝胶，将回收产物用T4 DNA连接酶连接。随后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，于含有苄青霉素的培养皿的LB平板37℃细菌培养箱培养12～16h。挑取质粒阳性克隆的菌落，酶切验证菌落的产物，选择酶切正确载体进行测序，测序引物CMV-F，BGH-R，正确质粒进行去内毒素手提，下传包装。

1.2.4 在HEK293细胞中制备ITPKB重组腺病毒：250μl DMEM和8μl PEI配成Mix 1，静置5min以上；250μl DMEM和酶切后的重组质粒配成Mix 2；将Mix 1和Mix 2混合，震荡混匀，离心后静置30min；随后与新铺6孔板HEK293细胞[(0.3～0.5)×106个/孔]混合置于细胞培养箱中培养约6h后更换培养液。观察90%细胞出现病变(Cytopathic effect，CPE)，收集上清继续感染HEK293细胞以扩增病毒；同时收集具有细胞病变效应(CPE)的细胞，离心，分别收集上清和细胞沉淀。

1.2.5 收集、纯化及浓缩腺病毒：病毒上清中加入NaCl和PEG8000后摇匀，4℃直立放置过夜后，离心，收集病毒沉淀，用2ml A195将病毒沉淀重悬，收集到15ml管中。细胞沉淀用6ml A195重悬，混匀，反复冻融4次。冻融时把样品放在干冰中冻12～15min，然后拿到37℃水浴锅中融2～3min，如此反复4次；4℃，离心，分别收集上清和沉淀(细胞碎片)，上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用2ml A195重悬后加入0.5ml 5mol/L NaCl至终浓度为1mol/L。超声破坏细胞碎片，离心完后，与病毒上清和细胞沉淀处理后的样品混合。采用碘克沙醇密度梯度离心纯化病毒，超滤管过滤收集浓缩病毒。

1.2.6 PCR检测腺病毒滴度：腺病毒破除病毒外壳，离心，取上清进行q-PCR检查。质粒标准品的拷贝数，7个梯度稀释浓度分别：2.58E+12vp/μl，2.58E+11vp/μl，2.58E+10vp/μl，2.58E+9vp/μl，2.58E+8vp/μl，2.58E+7vp/μl, 2.58E+6vp/μl，并将超纯水作为阴性对照。配制PCR反应体系，每个样品20μl体系(2X SYBR Green缓冲液 10μl、引物 0.8μl、超纯水 7.2μl、病毒样品或标准品 2μl)，进行PCR反应: 95℃ 5min；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 15s； 40个cycles。病毒颗粒数:病毒颗粒数(个/ml)=标准品相对值×1 000。

1.2.7 PCR检测pADM-ITPKB-FLAG-GFP与pADM-FH-GFP感染HEK293细胞：pADM-ITPKB-FLAG-GFP腺病毒感染HEK293细胞，MOI为10-3，设置为ADM-ITPKB组，pADM-FH-GFP腺病毒感染HEK293细胞，MOI为10-3，设置为ADM-FH-GFP组。设三个重复孔，24h后收取细胞并提取细胞总RNA。分光光度计测定提取 RNA 的浓度和纯度，逆转录RNA为cDNA并进行PCR检测，结果采取均数±标准差，两组组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 ITPKB基因扩增产物PCR鉴定 利用PCR方法扩增ITPKB基因后得到ITPKB片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的PCR产物大小约2 800bp，与Genbank中的ITPKB DNA 2 841bp大小一致，见图1。

图1 ITPKB基因的PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图

2.2 重组穿梭质粒pADM-ITPKB的鉴定 pADM-ITPKB阳性克隆的PCR和双酶切鉴定用ITPKB引物对随机挑选转化子进行PCR鉴定，经凝胶电泳检测出阳性转化子扩增获得约为3 000bp的条带；双酶切鉴定得到3 000bp的条带与ITPKB相当，表明阳性转化子中含有ITPKB的目的基因。见图2～4。

图2 包装前载体图

2.3 腺病毒的包装 助感染试剂(ADV-HR)和pADM-ITPKB-FLAG-GFP与pADM-FH-GFPrAd-pADM-GFP的包装穿梭质粒感染HEK293细胞1～2d，可见到光镜下可观察到空斑形成，细胞变圆、肿胀、脱壁、细胞核变大等病变。1周后荧光显微镜下可见大约40%的绿色荧光。第12日，可见大部分包装细胞肿胀脱落。荧光显微镜观察视野满布绿色荧光(图5)，重组腺病毒构建成功。

图3包装后载体图

图4限制性核酸内切酶酶切后电泳图

图5 重组腺病毒在HEK293细胞表达绿色荧光蛋白

2.4 病毒滴度的测定 经过反复感染、扩增，根据TCID50法进行滴度测定，测得重组腺病毒滴度5×1010PFU/ml，重组腺病毒滴度1×1010PFU/ml。pADM-ITPKB-FLAG-GFP阳性克隆测序鉴定结果显示正确。

2.5 q-PCR检测HEK293细胞mRNA表达量 ADM-ITPKB组HEK293细胞ITPKB mRNA的表达量为ADM-FH-GFP组的 22 851.6 倍，两组间比较具有统计学意义。见图6。

图6 ADM-FH-GFP组与ADM-ITPKB组ITPKB表达量的比较与ADM-FH-GFP组比较,

3 讨论

研究发现细胞内Ca2+超载可能与局麻药毒性相关并通过以下途径导致细胞损伤[6-8]，第一，通过线粒体途径。当细胞内Ca2+超载时，线粒体可通过Ca2+转运器摄取胞内Ca2+，当超过一定范围时，可造成线粒体通透转运孔道(Permeability transition pore，PTP)开放，许多大分子物质可由此通道进入线粒体，造成线粒体膜电位改变及功能障碍，最终导致细胞死亡。第二，通过激活钙敏感相关酶途径。当细胞内钙超载时，Ca2+可激活Ca2+依赖性磷脂酶，导致膜磷脂分解，同时产生游离脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等产物，而这些产物均对细胞代谢产生毒性作用。此外Ca2+还可激活钙蛋白酶，而钙蛋白酶是各种细胞毒物质造成细胞死亡的重要物质。

ITPKb可通过介导IP3生成IP4参与细胞内Ca2+调节。一方面，IP3是细胞内重要的第二信使分子，通过作用于胞浆中的肌醇三磷酸受体，促进内质网内的钙释放，Ca2+可与钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合形成Ca2+-CaM复合物，激活下游钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)，形成Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号通路诱发细胞凋亡。另一方面ITPKB可能通过上调IP4, 与特异性蛋白Ras3结合，抑制Ras/ERK1/2活性，抑制Bim活化，从而抑制细胞凋亡[9]。

本课题以人源ITPKB为目的基因。采用重组腺病毒载体系统成功构建了pADM-ITPKB-FLAG-GFP，所获病毒滴度较高，序列测序和PCR签定结果表明重组腺病毒ITPKB基因表达正确。通过q-PCR检测腺病毒感染HEK293细胞后ITPKB mRNA的表达量，表明腺病毒可上调ITPKB基因表达。本研究为ITPKB基因治疗和局麻药毒性研究提供了某些参考。