TLR信号通路关键因子在肺腺癌组织中的表达与临床意义

宋鹏涛 马志红 许丽敏 周凌燕 张建斌 平金良

肺癌是我国乃至世界范围内常见的恶性肿瘤，因缺乏有效的诊断标志物造成其早期诊断率低及预后判断难，一旦发现大部分已处于晚期，导致治疗效果差、预后不良、病死率极高，严重威胁人类的健康[1]。随着对炎症与肿瘤生长相关关系研究的不断深入，发现慢性感染和炎症在促进肿瘤发生和演化过程中起着十分重要的作用，被认为是最重要的后天性和环境因素[2]。大量的研究结果均表明炎症免疫系统的激活与癌症的发生有关，以慢性炎症为特点的肿瘤微环境，能促进肿瘤的发生和发展[3-4]。

Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）在固有免疫应答中发挥着重要的作用，国内外大量的研究表明其与肺癌的发生存在一定的相关性。何凤莲等[5]及高胜利[6]研究表明 Toll样受体 4（Toll-like receptors 4，TLR4）蛋白的表达与非小细胞肺癌的组织分化程度密切相关。笔者前期研究也表明TLR4和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白在肺腺癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织，因而进一步采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法和RT-PCR法研究TLR4及其相关信号通路关键因子在肺腺癌组织中的表达及临床意义，以期为肺腺癌的早期诊断和临床预后评估提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年7月至2018年12月于本院手术治疗的肺腺癌患者92例作为研究对象，其中男42例，女 50 例，年龄 30～78（58.0±22.5）岁。均经 2 位病理科医生确诊，手术前均未接受过放射治疗和化学药物治疗等处理。肿瘤组织标本均按2009年国际抗癌联盟（AJCC）TNM分期标准进行临床分期，其中Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期39例；低分化45例，高、中分化47例。并选择其中30例距肿瘤5cm远的正常肺组织作为对照。

1.2 主要试剂 TLR4抗体（批号：3253-100）、髓样分化因子 88（myeloid different iation factor88,MyD88）抗体（批号：3244R-100）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）抗体（批号：3566R-100）均购自美国 BioVision公司，NF-κB抗体（批号：ab16502）、白介素-1 受体相关激酶-1（Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1）抗体（批号：ab238）、IRAK4 抗体（批号：ab119942）均购自英国abcam公司。Super ScriptTMⅢ逆转录酶（批号：11904018）购自美国Invitrogen公司。

1.3 TLR信号通路关键因子蛋白表达量检测 将存档的肺腺癌组织和正常肺组织标本进行切片，厚约4μm。采用免疫组化法检测，操作步骤按检测试剂盒说明书进行：常规方法脱蜡，梯度乙醇（95%、85%、75%）脱水，抗原修复液（0.01M的枸橼酸钠缓冲液，pH6.0）修复2次，PBS洗涤3次，一抗（1∶2 000兔抗人）4℃过夜（阴性对照所用的一抗为正常羊血清），磷酸缓冲盐溶液洗涤，加入二抗，37℃孵育30min，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片后进行观察。TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6蛋白的免疫组化结果判断标准参考Yu等[7]报道的方法，光学显微镜下观察组织标本的着色范围与着色强度。TLR4、MyD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6蛋白的阳性表达主要表现为细胞质及细胞膜上呈现棕黄色或棕褐色颗粒，NF-κB蛋白的阳性表达主要表现为细胞质或细胞核中有棕褐色或棕黄色颗粒沉淀。随机选取5个不同的视野，计算阳性细胞总数，按阳性细胞数所占百分比计算分值：≤10%为1分，＞10%且≤50%为2分，＞50%且≤75%为3分，＞75%为4分。同时按照染色的强弱程度计算分值：阴性为1分，弱染色为2分，中等染色为3分，强染色为4分。上述两种分值的乘积作为最终结果：＜4 分为－；4～7 分为＋；8～12分为＋＋；13～16 分为＋＋＋。＋＋和＋＋＋为高表达，－和＋为低表达。

1.4 TLR信号通路关键因子mRNA表达水平检测 采用TRIzol提取肺腺癌和正常肺组织的总RNA，进而利用Super ScriptTMⅢ逆转录酶转录合成cDNA。设计引物进行采用RT-PCR法检测。所有样品均分3管同时扩增，计算单个样品的循环阈值（Cycle threshold,CT）值并取平均值，TLR信号通路关键因子mRNA的表达水平采用 2-ΔΔCt方法计算。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料用±s表示，计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织和正常肺组织TLR信号通路关键因子蛋白表达的比较TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4蛋白在肺腺癌组织中的高表达率分别为76.09%（70/92）、70.65%（65/92）、67.39%（62/92）、68.47%（63/92）、64.13%（59/92），在正常肺组织中的高表达率分别为 16.67%（5/30）、13.33%（4/30）、10.00%（3/30）、13.33%（4/30）、6.67%（2/30），两者比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。TRAF6蛋白在肺腺癌组织中的高表达率为 20.65%（19/92），与正常肺组织的 20.00%（6/30）比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图1（插页）。

2.2 不同临床病理特征肺腺癌患者肺腺癌组织中TLR信号通路关键因子蛋白表达强度的比较 不同性别、年龄、肿瘤大小、分化程度患者TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4蛋白比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），而不同程度淋巴结转移、临床分期、远处转移患者上述蛋白比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。不同性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期、远处转移患者TRAF6蛋白比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌组织和正常肺组织TLR信号通路关键因子mRNA表达水平比较 肺腺癌组织中TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1和IRAK4 mRNA表达水平均明显高于正常肺组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而TRAF6 mRNA的表达水平与正常肺组织比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

3 讨论

肿瘤的发生和发展是一个多阶段、多系统共作用的复杂过程，其主要包括细胞致瘤性转化、抗凋亡、促生长、免疫逃脱及侵袭与转移等这几个过程[3]。近年来的临床和流行病学研究均表明在肿瘤的发生和发展过程中慢性感染和炎症起着十分重要的作用，尤其炎症是肿瘤产生过程的一个关键因子。

TLR是介导免疫反应过程中的一个重要信号通路，其主要通过识别病原相关分子模式激活机体免疫反应，大量的研究表明TLR介导的信号通路与癌症的发生、发展有着密切的相关性，如胃癌、肠癌、乳腺癌的发生均与TLR表达上调密切相关[2-4]。TLR4是与肿瘤的发生和发展最为密切的TLR家族成员之一，在对肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌等癌细胞的发生、发展及其生长转移研究过程中也发现TLR4多表达于上述肿瘤细胞，且其与生长转移存在一定的关联性[8-9]。Chen等[10]利用细菌组成成分及内源性配基进行刺激发现TLR激活NF-κB从而刺激了内部促炎因子的产生，进而促进肿瘤生长及化疗药物抗药性的产生。Kelly等[11]利用LPS刺激人卵巢癌细胞，发现其可激活NF-κB信号通路，激活下游促炎因子的产生，进而促进肿瘤细胞的增殖，同时，该研究还发现 TLR4主要表达于人卵巢癌细胞表面。本研究结果表明，肺腺癌组织中TLR4、NF-κB蛋白的阳性高表达率分别为76.09%（70/92）和70.65%（65/92），显著高于正常肺组织，TLR4、NF-κB 在肺腺癌组织中的表达上调可能参与病程的发生、发展。此外，相关性分析结果显示，肺腺癌组织中TLR4、NF-κB蛋白的高表达与肺腺癌患者的分期、远处转移有较强的相关性，提示上调表达的TLR4、NF-κB可能与患者的预后相关，这与Inoue等和Pikarsky等[12-13]的研究结果一致。

表1 不同临床病理特征肺腺癌患者肺腺癌组织中TLR信号通路关键因子蛋白表达强度的比较

续表

众所周知，MyD88是TLR信号转导通路中最重要的衔接蛋白。它首先与IRAK4结合，进而促进IRAK4介导的IRAK1磷酸化，之后被高磷酸化的IRAK1进入胞质募集可溶性TRAF6，进而激活其相关的2种信号通路[14]。为进一步确定TLR信号通路关键因子在肺腺癌组织中的表达情况及相关性，笔者对其下游信号通路关键因子进行检测，发现MyD88、IRAK1、IRAK4在肺腺癌组织均呈高表达。查道德等[15]对LPS刺激的肺癌细胞株（A549）和非小细胞肺癌细胞株（H1299）研究发现，可通过诱导TLR4信号通路，刺激免疫抑制因子的产生，进而促进肺癌细胞的免疫逃逸。本研究结果也提示肺腺癌组织中TLR4和NF-κB的表达水平显著高于正常肺组织，同时，其下游通路关键因子MyD88、IRAK1、IRAK4的表达水平也相应的随着前两者的升高而升高，表明MyD88、IRAK1、IRAK4的表达受其调控，这也从另一角度表明其可通过TLR4/NF-κB信号通路诱导相关细胞因子的产生，进而使肺腺癌细胞逃避免疫监视，促进肿瘤细胞增长。同时，本研究结果也提示TRAF6的表达水平与之并无显著的相关性，但最近的多项研究表明，TRAF6在多种肿瘤的形成和发展中发挥重要作用[16]，同时，Sun等[17]和Han等[18]敲除TRAF6基因后发现食管癌细胞的增殖明显的受到了抑制作用，这表明TRAF6参与了食管癌的发生、发展和侵袭作用，但本研究结果表明TRAF6的表达与肺腺癌的发生无显著相关性，其具体原因有待进一步研究。

综上所述，本研究从不同角度验证了TLR信号通路关键因子 TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、IRAK4 在肺腺癌中高表达与其淋巴结转移、临床分期、远处转移相关，表达上调的信号通路关键因子参与了肺腺癌的发生、发展及预后等进程，但其具体机制仍需进一步深入研究。