液相色谱串联质谱快速检测水中喹诺酮类药物及其应用

何欣，柳爱春，刘超，白俊慧，虞轶俊，赵芸*，丁明

(1.杭州市农业科学研究院 实验中心，浙江 杭州 310024； 2.浙江省耕地质量与肥料管理总站，浙江 杭州 310020;3.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400)

喹诺酮类药物是一类比较新的合成抗菌药，抗菌谱广，抗菌力强，口服吸收好，组织浓度高，与其他抗菌药物无交叉耐药性，不良反应相对较少，现已经成为治疗细菌感染性疾病的主要药物，在临床治疗和农业生产中广泛应用。然而，近些年的研究表明，喹诺酮类药物除了会引起胃肠道反应、中枢神经系统异常、软骨毒性、心脏毒性等方面的不良反应外[1-4]，还有生态毒性。我国有超过半数的喹诺酮类抗生素被用在畜禽与水产养殖中，动物与水生生物体内抗生素的蓄积易导致细菌耐药性的产生，进而可能影响到人类健康[5]。同时，抗生素在生物体内的利用度较低，绝大多数抗生素药物最终会进入到环境中，残留在环境中的喹诺酮类抗生素一旦进入水体，就有可能对水环境中的非靶生物及生态系统产生不良影响[6-8]。

关于抗生素在水体中的含量检测方法已有一些报道，包括快速检测试剂盒、酶联免疫检测、毛细管电泳分析和液相分析等。其中，液相色谱串联质谱技术因具有高准确度和高灵敏度而成为目前主要应用的化学分析技术[9-12]。本研究建立了一种可对水中15种喹诺酮类药物进行快速检测的方法。该方法有助于加深对水体本底中抗生素含量和种类变化的了解，明确抗生素在环境中的迁移信息和防范风险，同时，相关研究的结果还可为相关部门制定规范、标准提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)：Waters Xevo TQ-S，配电喷雾离子源(ESI)，Waters公司；高速离心机，Bioridge公司。氮吹仪，Organomation公司。

甲醇，色谱纯，Fisher Chemical公司。甲酸，色谱纯，ROE Scientific公司。乙腈，色谱纯，Fisher Chemical公司。15种喹诺酮类药物(氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星、加替沙星、沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星)标准品，纯度≥95%，DR公司。

固相萃取小柱：60 mg/3 mL，Waters公司；微孔有机滤膜，0.22 μm。

另配制NaH2PO4、Na2HPO4物质的量之比为9∶1的0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲液。

1.2 样品制备与前处理

将1 L混匀的水样，经布氏漏斗过滤后，收集滤出液，重复收集一次，合并滤液，过0.22 μm水相滤膜，准确量取500 mL备用。

准确量取500 mL水样于1 000 mL引流设备中，加入50 mL 0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲液，用玻棒混匀2 min，室温下避光引入3 mL的固相萃取柱上，固相萃取柱先以5 mL甲醇活化，用5 mL超纯水洗涤。水样以1 mL·min-1左右的流速经过固相萃取柱后，加入3 mL 5%(体积分数)的甲醇洗涤，用6 mL甲醇洗脱。洗脱液在40 ℃下氮气吹干后，用流动相定容至0.5 mL，涡旋30 s后转移至2 mL高速离心管，15 000 r·min-1离心10 min，过0.22 μm滤膜，滤液上机待用。

1.3 色/质谱条件优化

1.3.1 质谱条件

采用直接注射方式进样，对15种喹诺酮类药物标准溶液(1.0 μg·mL-1)分别在正离子模式下进行质谱采集，获得15种喹诺酮类药物的母离子信息。通过改变碰撞能量，确定1～2个特征碎片，作为药物对应的子离子。同时，优化锥孔电压等参数，使得目标物的信号最强，确定检测目标物的定量离子对、定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数。

1.3.2 色谱条件

比较 ACQUITY BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY BEH Hilic(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY BEH amide(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)和ACQUITY HSS T3(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)色谱柱作为分离材料的效果。在以下条件先进行药物的分离。流动相A，水；流动相B，100%乙腈。程序：0～1 min，流动相A体积分数95%～90%，流动相B体积分数5%～10%；1～5.5 min，流动相A体积分数90%～10%，流动相B体积分数10%～90%；5.5～6 min，流动相A体积分数10%～90%，流动相B体积分数90%～10%；6～7 min，流动相A体积分数90%～95%，流动相B体积分数10%～5%。选取峰形和响应值均较好的色谱柱，优化流动相条件，优化时间梯度。

1.4 前处理方法优化

比较极性HLB固相萃取柱、混合型阴离子交换柱(MAX)和混合型阳离子交换柱(MCX)净化材料的吸附能力，比较甲醇和乙腈的洗脱效果，并对比pH分别为5.8、6.4和7.8时对提取样品中15种目标物进行分析的效果。

1.5 方法学验证和应用

方法准确度采用空白样品加标试验确定。对水样进行3个水平的加标回收试验(n=6)。空白样品中，分别以不同药物响应信号与噪音比为3倍和10倍定为检出限(LOD)与定量限(LOQ)，各药物的加标水平分别为LOQ、10×LOQ和100×LOQ，各药物加标水平设置为1.0～100 ng·L-1。对水样进行重复测定(n=6)，计算各药物平行测定的相对标准偏差(RSD)，并将建立的方法应用于杭州市水体9个断面中采样所得的样品。

2 结果与分析

2.1 质谱检测参数

采用直接注射方式进样，对15种喹诺酮类药物标准溶液(1 μg·mL-1)分别在正离子模式下进行质谱采集。结果显示，15种喹诺酮类药物具有较高的灵敏度，且主要以[M+H]+分子离子形式存在。每个分析物母离子选择2～4个信噪比(S/N)较高的子离子，优化锥孔电压，碰撞能量等质谱参数(表1)。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱选择

比较了4种色谱柱的分离效果，结果发现，在相同的洗脱条件下，各目标物在T3和Hilic色谱柱上分离度较差，在C18和amide上各药物均有不错的分离效果，但amide柱上信号较差，灵敏度比C18柱低。原因可能是：C18和Amide柱配基密度低，使得分析物能更容易地进入填料的微孔结构中，为极性和疏水性分子提供均衡的保留性能。综合来看，选择C18作为色谱柱。

2.2.2 流动相优化

改变流动相，在水相中加入0.1%(体积分数)甲酸后峰形和响应度大大提高。这是因为，加入甲酸后改变了流动相的pH值，使得目标物更容易吸附在色谱柱上，同时可使样品在质谱中的离子化程度大大提高，从而提升检测的灵敏度。

表1 UPLC-MS/MS法测定喹诺酮类药物的质谱参数

注：加粗为定量离子对。

对洗脱程序进行优化，结果发现，样品在水相为50%时已经完全洗脱，故可将洗脱梯度修改为流动相A，0.1%(体积分数)甲酸水溶液；流动相B，100%乙腈。程序修改为：0～1 min，流动相A体积分数95%～90%，流动相B体积分数5%～10%；1～5.5 min，流动相A体积分数90%～50%，流动相B体积分数10%～50%；5.5～6 min，流动相A体积分数50%～90%，流动相B体积分数50%～10%；6～7 min，流动相A体积分数90%～95%，流动相B体积分数10%～5%。流速0.4 μL·min-1。15种分析物的UPLC-MS/MS色谱图如图1所示，各目标物均得到较好的保留和分离。

2.3 净化效果评价

试验发现，HLB固相萃取小柱对所有喹诺酮类药物均有一定的吸附作用，而MAX和MCX小柱吸附能力较差。为此，本方法选用HLB柱作为净化材料。

以混合标准溶液(含各分析物100 ng·mL-1)作为监测和评价对象，比较分析了纯水和5%(体积分数)甲醇水溶液的淋洗效果，以及甲醇和乙腈的洗脱效果。选择5%的甲醇溶液可避免喹诺酮类药物在淋洗环节被洗脱，但如采用纯水进行淋洗，则无法达到对杂质的清除效果。经比较，采用5%甲醇水溶液作为淋洗液，更有助于降低基质效应。

考查甲醇和乙腈溶液对目标物的洗脱效果，结果表明：2种有机溶剂对各分析物均有良好的洗脱效果。考虑到乙腈过强的洗脱能力可能会引入较多的杂质并具有较大的毒性，因此,选择甲醇作为洗脱剂。

图1 优化后的各组分液相色谱

比较体积分别为3、6、10 mL的甲醇溶液的洗脱效果，结果表明，当采用6 mL的甲醇作为洗脱溶液时，回收率与10 mL甲醇的洗脱回收率基本一致，可满足定量分析要求。最终选择的洗脱液为6 mL的甲醇溶液。

2.4 提取效果

喹诺酮类药物分子极性较强，在不同的pH环境下，固相萃取柱对喹诺酮类药物的吸附、洗脱效果差异较大。设置不同的pH条件，对提取样品中15种目标分析物的效果进行比较。采用0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液调节pH，当NaH2PO4和Na2HPO4的物质的量之比分别为9∶1、1∶1和1∶9时，溶液pH值分别为5.8、6.4和7.8。向500 mL的过滤液中加入50 mL的磷酸盐缓冲液进行提取和富集。结果表明：在酸性环境下，即NaH2PO4和Na2HPO4的物质的量之比为9∶1时，喹诺酮类药物的提取富集效果较好，此时的溶液pH值约为5.8，会给萃取过程提供酸性环境，使得喹诺酮类药物更易富集在固相萃取柱上。

2.5 方法学验证及应用

试验结果表明，在100 ng·L-1的加标质量浓度下，上述方法的总体加标回收率为50.41%～111.64%，RSD为1.12%～14.26%，可满足方法的准确度要求。

试验对水样进行了3个水平的加标回收试验(n=6)。对于水样空白基质，各抗生素的加标水平分别为各自定量限LOQ、10×LOQ和100×LOQ，各药物加标水平分别设置为1.0、10.0、100 ng·L-1。水样样品的加标回收率为50.41%～111.64%，RSD为1.12%～14.26%，方法精密度可满足相关技术要求。

本方法为外标法定量。在确定的最佳条件下，按各分析物的响应值，将15种喹诺酮类药物配制成含1.0～100 ng·mL-1的混合标准工作溶液，做工作曲线。结果表明，本方法下各分析物浓度与质谱响应值的线性关系良好，其决定系数(R2)均大于0.990；各药物的最低LOD为1.0 ng·L-1，LOQ为1.0 ng·L-1(表3)。

将建立的方法应用于27个水样中，其中阳性样品4个，阳性率为14.81%。其中，检测出的喹诺酮类药物种类有麻保沙星、恩诺沙星和氧氟沙星。

表2 喹诺酮类药物加标回收试验结果(n=6)

表3 喹诺酮类药物的线性关系、方法检出限和定量限

3 小结

本研究建立了一种可对水中15种喹诺酮类药物进行快速检测的方法。水样经过滤、提取，在HLB固相萃取柱上浓缩1 000倍，净化，UPLC-MS/MS检测，样品的回收率为50.41%～111.64%，RSD为1.12%～14.26%，检出限和定量限为1.0 ng·L-1。将建立的方法应用于水样中，检测出阳性样品4个，阳性率为14.81%，其中，检测出的喹诺酮类药物种类有麻保沙星、恩诺沙星和氧氟沙星。