甲鱼蛋白肽的抗肿瘤作用及其对微管蛋白聚合-解聚的影响

马逊斌，楼博，何晨怡，王楠*，王伟

(1.浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

癌症是严重危害人类健康的重大疾病。从天然动、植物中寻找高效的抗癌活性物质已成为近年来的研究热点。抗肿瘤肽具有分子质量小、极易穿透癌细胞、稳定性较强等特点，可以通过提高免疫应答、抑制肿瘤血管形成等抑制肿瘤生长和转移[1]，根据作用机制分为受体干扰肽、蛋白间抑制肽、酶抑制肽和核酸间作用肽[2]。微管是真核细胞中重要的结构组分，由α和β微管蛋白异二聚体装配成长管状纤维结构[3]，作为细胞结构的组成部分参与多种细胞器的组成，在细胞分裂的有丝分裂期，微管蛋白起着决定性的作用[4]。已有研究发现，很多化合物能与微管蛋白结合，通过干扰微管的动力学行为，达到抑制微管正常功能的目的，导致有丝分裂障碍，诱导肿瘤细胞凋亡[5-7]，抑制微管功能已成为重要的发现抗肿瘤化合物的策略。

甲鱼又称鳖、潭鱼、嘉鱼、水鱼，是一种珍贵的水生经济动物。甲鱼肉质鲜嫩，含有丰富的蛋白质、矿物质元素及不饱和脂肪酸，具有强身健体、提高免疫、延年益寿、防癌抗癌的功效，是药食同源佳品[8-11]。本研究以甲鱼为原料制备甲鱼蛋白肽，并研究甲鱼蛋白肽对微管蛋白聚合-解聚的影响，为抗肿瘤活性肽的开发提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

甲鱼购自农贸市场，4-吗啉乙磺酸(MES)购自北京沃凯生物科技有限公司，EGTA、ATP、GTP、分离胶、浓缩胶、福林酚购自北京索莱宝科技有限公司，牛血清白蛋白购自SIGMA-ALDRICH公司，MgCl2、丙三醇、盐酸、无水碳酸钠、酒石酸钾钠、硫酸铜、甲醇、冰醋酸购自国药集团化学试剂有限公司，考马斯亮蓝R250购自白鲨生物科技，过硫酸铵购自厦门海标科技有限公司，四甲基乙二胺购自福州飞净生物科技有限公司，蛋白上样缓冲液购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.1.2 仪器

台式高速冷冻离心机，德国贺利氏公司；数显恒温水浴锅，常州市金坛友联仪器研究所；UV-124紫外可见分光光度计，岛津(中国)有限公司；XW-80A漩涡混匀机，上海精科实业有限公司；电泳仪、凝胶成像仪，美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 甲鱼蛋白肽制备

甲鱼宰杀→去脂→脱壳→打浆→冻干→中性蛋白酶酶解4 h→灭酶(100 ℃，10 min)→离心过滤(4 000 r·min-1，10 min)→取上清液→冷冻干燥→保存，备用[12]。

1.2.2 MTT法检测甲鱼蛋白肽对肿瘤细胞增殖的影响

取对数期的人肝癌细胞株HEPG2细胞，用质量分数0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释，制备1×105cell·mL-1的细胞悬液。将细胞悬液每孔100 μL接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的孵箱内培养24 h，待细胞贴壁后弃培养液，加入100 μL不同质量浓度的待测样品(6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1)。同时设立空白组(只加培养液)和对照组(只加细胞和培养液)，每组设3个平行孔，继续培养72 h后，每孔加入20 μL的5 mg·mL-1MTT溶液，孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，15 min后用酶标仪在波长490 nm处测定其吸光度值(D490)[13]，计算细胞增殖抑制率，并用多元回归法计算半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3 微管蛋白的分离与纯化

参照Landino等[14]方法进行猪脑微管蛋白提取。把新鲜的成年猪脑置于冰水中，浸泡一段时间后，去除脑膜、大血管，用预冷的MES缓冲液清洗，制成匀浆。将脑组织匀浆4 ℃ 10 000 r·min-1离心1 h，提取上清液，加入相同体积的MES聚合缓冲液，37 ℃水浴30 min，轻微摇晃数次，26 ℃ 10 000 r·min-1离心1 h，去除上清，用MES缓冲液预冷却，冰水浴30 min至沉淀物基本溶解，然后将溶液在高温和低温下各离心1次，离心得到的沉淀用少量MES缓冲液溶解在冰水浴中，得到微管蛋白溶液。

1.2.4 微管蛋白含量测定

参考李荣贞等[15]方法测定微管蛋白含量。

1.2.5 微管蛋白的鉴定

用质量分数为12%的分离胶(pH 8.8)、5%的浓缩胶(pH 6.7)进行SDS-PAGE电泳，0.05%考马斯亮蓝R250染色并观察。

1.2.6 微管蛋白聚合和解聚动态平衡反应

在冰浴的比色皿中加入已纯化的微管蛋白195 μL，然后加入ATP 5 μL，使其终浓度为1 mmol·L-1。在4 ℃、350 nm处迅速调零，置于37 ℃水浴中恒温，每隔3 min取出测定吸光度D350，根据所测得的吸光度的变化绘制微管蛋白聚合曲线。当聚合曲线逐渐上升进入稳定高平台期时说明微管蛋白聚合反应趋于平衡，待聚合反应基本结束后，将比色杯放入冰水中冰浴20 min，在此期间每间隔3 min测定D350，当解聚曲线逐渐下降并进入低平台期后，解聚反应基本结束。

1.2.7 甲鱼蛋白肽对微管蛋白聚合-解聚活性的影响

在上述微管蛋白聚合-解聚的反应系统中，实验组加入不同浓度的甲鱼蛋白肽(5 μL)，使其终浓度分别为0.5、0.75、1.5 mg·mL-1，按1.2.6节的测定方法记录D350的变化。

1.2.8 结果评价

抑制率=100%(对照组D350-实验组D350)/对照组D350。

2 结果与分析

2.1 甲鱼蛋白肽对肿瘤的抑制活性

以不同浓度的甲鱼蛋白肽(6.25～100 μg·mL-1)处理人肝癌HEPG2细胞72 h，设空白和对照，结果如图1。与对照组相比，在各浓度观察点甲鱼蛋白肽均有显著的抑制作用(P<0.05)，有效浓度为6.25～100 μg·mL-1，并呈良好的量效关系，半抑制浓度(IC50)为228.49 μg·mL-1。

图1 甲鱼蛋白肽对HEPG2细胞增殖的剂量依赖抑制效应

2.2 微管蛋白含量的测定与鉴定

按Lowry法[15]测定总蛋白浓度为13.95 g·L-1，经SDS-PAGE电泳结果显示，总蛋白样品中主要组分的相对分子质量介于45.0×103～66.2×103，与文献所报道相符[16]，因此，图2中出现的蛋白条带即为本实验所需的微管蛋白。

图2 猪脑微管蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.3 微管蛋白聚合和解聚动态平衡反应

微管蛋白在37 ℃条件下聚合(0～10 min)，在4 ℃条件下解聚(40～60 min)，平台期反应了微管蛋白在聚合条件下聚合-解聚之间的动态平衡(图3)。微管蛋白在正常的生理条件下处于聚合-解聚动态平衡中，从而在细胞形态结构、细胞分裂和运动中起着重要作用。

图3 微管蛋白在37 ℃时的聚合与4 ℃时的解聚曲线

2.4 甲鱼蛋白肽对微管蛋白聚合-解聚反应的影响

根据其具体结合部位的不同，主要分为3类：紫杉醇位点抑制剂，长春碱位点抑制剂和秋水仙碱位点抑制剂。结合于紫杉醇位点的化合物是抑制微管蛋白解聚的微管蛋白聚合剂；而结合于后2个位点的抑制剂则正好相反，为微管蛋白解聚剂。无论是抑制聚合还是抑制解聚，均是通过干扰微管的动力学行为，而达到抑制微管正常功能的目的[17-19]。

从图4可看出，甲鱼蛋白肽对微管蛋白的聚合有明显的抑制作用，且与浓度有关。甲鱼蛋白肽的终浓度为0.5、0.75、1.5 mg·mL-1时，对微管蛋白聚合的抑制率分别为19.7%、25.6%、40.2%。甲鱼蛋白肽对微管蛋白聚合的抑制作用与浓度呈正相关。

图4 甲鱼蛋白肽对微管蛋白聚合-解聚反应的影响

3 讨论

国内外有关生物活性肽及其抗肿瘤的研究已显示出强大的应用和开发前景[20-24]。1976年Pettit首次从海兔中发现环肽类抗肿瘤活性成分，其后从海兔中分离出一系列含量很低的小分子肽。易杨华等[23]从我国西沙群岛永兴岛棕色海绵提取到一种新的类环肽化合物，具有较好的抗肿瘤活性。海鞘是抗肿瘤活性肽的重要资源之一[24]。研究人员从海洋藻类、鱼类和贝类中发现了许多高活性的抗肿瘤肽[25-27]。本实验以中性蛋白酶酶解制备的甲鱼蛋白肽，在实验浓度范围内均有抑制肝癌HEPG2细胞增殖的作用。

微管是抗肿瘤药物的重要作用靶点，微管蛋白在有丝分裂中的重要作用，使之成为抗肿瘤药物的有力靶点。迄今为止，已发现了多种生物活性肽能够影响微管蛋白的聚合-解聚。Pettit从海兔中分离出Dolastatin 10和Dolastatin 15能够抑制微管聚合并促进其解聚，干扰肿瘤细胞的有丝分裂[22]。王翠翠等[28]研究表明，文蛤多肽能够干扰微管蛋白的聚合。本实验研究表明，甲鱼蛋白肽对微管蛋白的聚合具有抑制作用，且与浓度呈正相关，提示甲鱼蛋白肽具有潜在的抑制微管蛋白聚合的作用。

4 小结

本实验评价了甲鱼蛋白肽的抗肿瘤作用，在6.25～100 μg·mL-1，甲鱼蛋白肽具有抑制肿瘤作用，并呈良好的量效关系，IC50为228.49 μg·mL-1。甲鱼蛋白肽对微管蛋白的聚合具有抑制作用，且与浓度呈正相关，1.5 mg·mL-1的甲鱼蛋白肽的抑制率达40.2%，提示甲鱼蛋白肽对微管蛋白动态平衡体系的影响可能是抑制肿瘤细胞增殖的途径之一。