孕晚期妇女与新生儿血浆维生素A水平的相关性分析

李秀翠，周玉博△，司可艺，李宏田，张 乐，张亚黎，刘菊芬，刘建蒙△

(1. 北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京 100191； 2. 北京大学生育健康研究所，国家卫生健康委员会生育健康重点实验室，北京 100191)

维生素A(vitamin A，VitA)是人体必需脂溶性维生素，参与胎儿视觉和骨骼发育、免疫系统维持等多种生理功能[1-2]。孕期VitA缺乏可增加胎儿出生体质量降低[3]和骨骼发育不良[4]的发生风险。新生儿VitA营养水平影响体格发育[5]、呼吸系统[6]和神经系统发育[7]及婴儿期死亡风险[8]等。探讨孕晚期VitA水平与新生儿VitA水平的关系对于改善新生儿营养状况，降低不良出生结局具有重要公共卫生和临床意义。既往有小样本研究提示了孕晚期母血与新生儿脐带血VitA水平有相关性[9-10]，但未见有定量分析两者之间是否存在剂量-反应关系的研究，也少有定性分析孕妇VitA缺乏对新生儿VitA缺乏影响的研究。此外，脐带血VitA是由母血VitA经胎盘主动转运而来[11]，然而胎盘主动转运能力是否受孕妇VitA水平影响也未见报道。

本研究分析了688对孕晚期妇女和新生儿血浆VitA水平，评价两者间的剂量-反应关系，分析孕晚期VitA缺乏对新生儿VitA水平的影响，并探讨母血VitA水平与胎盘转运能力的关联性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2009年5月至6月在河北省元氏县和乐亭县募集孕妇，随访观察至分娩。孕妇纳入标准：募集时妊娠<20周，并建立围产保健手册；年龄≥20周岁；本次怀孕为单胎；无生育史；妊娠结局为娩出活产儿；本地长期居住者；生活能够自理且自愿参加本项目。共募集到817例孕妇，排除未采集临产前静脉血或分娩时脐带血样本(n=2)、样本溶血或采集不足(n=120)、基本信息缺失(n=4)、或VitA测定值异常者(n=3)，最终纳入分析688对孕妇和新生儿资料。本研究项目经北京大学生物医学伦理委员会审查通过后实施(批准号：IRB00001052-11024)。

1.2 基本信息收集

由经统一培训的医院产科项目人员收集孕妇及新生儿的基本信息。孕妇信息包括年龄、募集孕周、分娩孕周、职业、文化程度、募集时体重指数和血红蛋白浓度。新生儿信息包括性别、早产、出生体重和出生身长。

1.3 样本采集与测定

样本采集：采用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝管采集临产前静脉血和分娩时脐带血5 mL，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，分离出血浆并短期储存于-20 ℃冰箱。冷链运输样本至国家卫生健康委员会生育健康重点实验室，于-80 ℃冰箱冻存待测。

样本测定：采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测血浆中视黄醇，以视黄醇浓度代表VitA水平。检测所用仪器主要包括高效液相色谱仪(Alliance 2690)、双通道紫外分光检测器(Waters 2489)、C18反向色谱柱(填料HSS T3，5 μm，4.6×150 mm)，均购自美国Waters公司。所用试剂包括视黄醇标准液(0.1 g/L，Cerilliant公司，美国)、视黄醇乙酸酯(Sigma公司，美国)，其他试剂如色谱纯级别的无水乙醇、甲醇、乙腈等购自美国Fisher公司。检测过程为：在25 μL待测血浆中，加入50 μL视黄醇乙酸酯内标溶液和125 μL乙腈，充分震荡后，25 ℃室温下15 000 r/min离心3 min，吸取80 μL上清液至有盖的自动采样瓶中进样检测。流动相为乙腈 ∶水(85 ∶15)，流速1 mL/min，柱温35 ℃，进样温度20 ℃，检测波长325 nm。每20个样本进行一次盲样质控，每轮测定前后放入高、中、低质控。样本处理与检测均在国家卫生健康委员会生育健康重点实验室BSL-2黄光实验室内进行，检测过程严格避光。

1.4 VitA营养状况及相关指标判定

孕妇VitA营养状态判定：采用世界卫生组织的判定标准[12]，定义孕妇血浆视黄醇浓度<0.70 μmol/L为缺乏(VitA deficiency，VAD)， 0.70～<1.05 μmol/L为边缘性缺乏(marginal VitA deficiency，MVAD)，≥1.05 μmol/L为充足。新生儿VitA营养状态判定：由于尚无脐带血VitA分类标准，本研究采用两种方法判定：一是根据标准人群维生素A缺乏筛查方法(WS/T 553—2017)中6岁以下儿童VitA营养状态的判定方法，定义脐带血血浆视黄醇浓度<0.35 μmol/L为VAD，0.35～<0.70 μmol/L为MVAD，≥0.70 μmol/L为充足[13]；二是将脐带血血浆视黄醇浓度低于第10百分位数(0.62 μmol/L)定义为新生儿VitA相对缺乏，高者定义为充足。VitA胎盘转运系数(VitA placental transport ratio，VitA-PTR)：新生儿与孕妇血浆视黄醇浓度比值[14]，作为衡量胎盘主动转运VitA效率的指标。

1.5 统计学分析

孕妇及新生儿的视黄醇浓度等连续变量采用均数±标准差描述其平均水平，孕妇及新生儿VitA营养状态等分类变量采用频数和百分比描述。采用单因素和多因素Pearson相关探讨孕妇与新生儿血浆VitA水平的相关性，采用多元分式多项式(multivariable fractional polynomials, MFP)模型探讨两者的剂量-反应关系，采用单因素和多因素Logistic回归模型探讨孕妇VitA营养状态对新生儿VitA营养状态的影响。采用MFP模型及单因素和多因素Spearman相关探讨孕妇VitA水平与VitA-PTR的关系。多因素模型中调整的因素包括孕妇年龄、体重指数、贫血状态、地区、职业、文化程度、分娩孕周和新生儿性别。数据分析使用R 3.5.0 统计软件完成，双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况

孕妇平均年龄为(23.7±3.7)岁，平均分娩孕周为(39.5±1.7)周，职业以农民为主(88.0%)，文化程度多为初中及以下 (80.4%)。孕晚期妇女视黄醇平均浓度为(1.15±0.30) μmol/L，VAD率为4.5%(31/688)， MVAD率为37.8%(260/688)。新生儿中男性占45.6%，早产儿占 4.2%。新生儿视黄醇平均浓度为(0.78±0.13) μmol/L，约为孕晚期妇女视黄醇浓度的68.0%，无VAD，MVAD率为28.2%(194/688)， 详见表1。

表1 孕妇及新生儿的基本特征和血浆VitA水平

2.2 孕晚期妇女和新生儿血浆VitA水平的相关性

孕妇和新生儿VitA水平总体相关系数r=0.14(P<0.001)， 孕妇处于VAD状态时二者相关性增强，呈中度相关(r=0.34，P=0.05，表2)。经多因素调整后，总体相关系数变化不大(radj=0.13，P<0.01)， VAD孕妇与新生儿VitA水平相关系数进一步增大(radj=0.45，P=0.03)。

表2 孕晚期妇女和新生儿VitA水平Pearson相关分析

a,rdenotes Pearson correlation coefficient; b,radjdenotes Pearson correlation coefficient adjusted by multi-variables, including maternal age, body mass index at enrollment, hemoglobin level, county, occupation, education, gestational age at delivery and neonatal gender. VitA, vitamin A.

调整孕妇年龄等协变量后，孕妇与新生儿血浆VitA水平的MFP拟合模型为一阶MFP，幂参数等于1，模型公式为：FP1=0.71+0.06X，其中X表示孕妇血浆视黄醇浓度(P<0.05)，其余变量均未能纳入模型(P>0.05)。

模型提示孕妇与新生儿VitA水平呈正向线性剂量-反应关系(图1)，孕妇视黄醇浓度每增加1 μmol/L，新生儿视黄醇浓度相应增加0.06 μmol/L(P<0.001)。

依据6岁以下儿童VitA缺乏的判定标准，与VitA充足组孕妇相比，VAD组(crudeOR=2.20，95%CI：1.04～4.66)和MVAD组孕妇(crudeOR=1.43，95%CI：1.01～2.02)分娩MVAD新生儿的发生风险显著升高，经多因素调整后，上述效应不具有统计学意义。以新生儿视黄醇浓度的第10百分位数为标准，与VitA充足组孕妇相比，VAD组孕妇分娩VitA相对缺乏新生儿的风险增加(crudeOR=3.02，95%CI：1.21～7.50)，多因素调整后该风险仍显著增加(adjustedOR=2.76，95%CI：1.05～7.22)；孕妇MVAD组新生儿VitA相对缺乏风险未见显著增加，详见表3。

表3 孕妇VitA营养状态对新生儿VitA缺乏的影响

a, marginal VitA deficiency was defined according to method for vitamin A deficiency screening (WS/T 553—2017) for children at or younger than 6 years; b,relative VitA deficiency was defined as values of cord blood plasma retinol concentration below the 10th percentile. VitA, vitamin A.

2.3 孕晚期妇女VitA水平和VitA-PTR的相关性

单因素(rs=-0.84，P<0.001)和多因素(rsadj=-0.82，P<0.001)Spearman相关分析结果均显示VitA-PTR与孕妇VitA水平呈高度负相关。按孕妇VitA营养状态分层分析发现，在孕妇VitA充足组和MVAD组，VitA-PTR与孕妇VitA水平呈负相关；在孕妇VAD组，两者不再有显著相关性。按新生儿VitA营养状态分层分析发现，无论新生儿处于何种VitA营养状态，孕妇VitA水平与VitA-PTR均存在高度负相关(表4)。

表4 孕晚期妇女VitA水平与VitA-PTR的Spearman相关

a,rsdenotes Spearman correlation coefficient; b,rsadjdenotes Spearman correlation coefficient adjusted by multi-variables, including maternal age, body mass index at enrollment, hemoglobin level, county, occupation, education, gestational age at delivery and neonatal gender.; c, first definition method was defined according to method for vitamin A deficiency screening (WS/T 553—2017) for children at or younger than 6 years; d, second definition method was defined as values of cord blood plasma retinol concentration below the 10th percentile. VitA, vitamin A; VitA-PTR, VitA placental transport ratio.

MFP模型进一步分析显示，调整孕妇年龄等协变量后，孕妇血浆VitA水平与VitA-PTR的最佳FP拟合模型为一阶FP，幂参数等于-0.5，模型公式为：FP1=-0.59+1.37X-0.5，其中X表示孕妇血浆视黄醇浓度(P<0.05)，其余变量均未能纳入模型中(P>0.05)。

模型表明孕妇VitA水平与VitA-PTR呈负向非线性剂量-反应关系(图2)，即VitA-PTR随孕妇视黄醇浓度升高而下降，且下降速率逐渐变慢。

3 讨论

本研究发现中国北方农村地区孕晚期妇女和新生儿VitA缺乏率低，而边缘性缺乏率较高；孕晚期妇女与新生儿的血浆VitA水平呈正向线性剂量-反应关系，孕晚期VitA缺乏可增加新生儿VitA相对缺乏的发生风险；孕妇血浆VitA水平与胎盘对VitA主动转运能力呈负向非线性剂量-反应关系。

研究显示孕晚期妇女视黄醇平均浓度为(1.15±0.30) μmol/L，VitA缺乏率近5%，边缘缺乏率高达38%；新生儿脐带血视黄醇平均浓度为(0.78±0.13) μmol/L，无VitA缺乏，边缘缺乏率高达28%。胡贻椿等[15]研究显示中国农村孕妇视黄醇浓度为1.53 μmol/L，略高于本研究结果，这可能与两项研究中孕妇所处妊娠阶段不同有关。本研究孕妇处于孕晚期，因孕妇血容量增大、胎儿VitA需求增加等原因，孕妇体内VitA水平降低[16]。本研究新生儿脐血血浆视黄醇浓度占孕妇静脉血血浆视黄醇浓度的68%，与既往报道的50%～70%一致[9, 17-18]。

研究显示孕晚期妇女静脉血血浆与新生儿脐带血血浆VitA水平呈正向线性剂量-反应关系(radj=0.13，P<0.01)，孕妇VitA缺乏状态时相关性增强(radj=0.45，P=0.03)。国内外研究也证实孕妇和新生儿VitA水平存在弱但显著的正相关关系(r2=0.27，P<0.001)[9, 19]，与本研究结果相似，另有研究显示二者之间存在着正相关趋势(r=0.15，P=0.06)[20]。在既往研究结果基础上，本研究进一步利用MFP模型明确了孕晚期母血与新生儿脐带血VitA水平间存在正向线性剂量-反应关系，为今后通过孕妇VitA水平预测新生儿VitA营养状况提供了模型支持。目前仅有一项研究报道了母亲VitA缺乏可增加新生儿VitA缺乏的发生风险(OR=4.79，95%CI：2.40～9.57)[18]，但该研究中孕妇与新生儿采用相同的VitA缺乏标准(VAD定义为血清视黄醇浓度<1.05 μmol/L)。本研究以脐带血视黄醇浓度的第10百分位数为标准定义新生儿VitA相对缺乏，发现与VitA充足组孕妇相比，缺乏组孕妇分娩VitA相对缺乏新生儿的风险升高；而按人群维生素A缺乏筛查方法(WS/T 553—2017)中6岁以下儿童VitA营养状况判定标准，缺乏组孕妇分娩VitA边缘缺乏新生儿的风险未见显著增高。两种判定标准所得结果不完全相同，可能与样本量有关，也可能因母体VitA缺乏可使新生儿VitA处于较低水平，如判定新生儿VitA相对缺乏所用的脐带血视黄醇浓度第10百分位数为0.62 μmol/L，低于新生儿VitA边缘缺乏判定界值0.70 μmol/L，这部分结果也提示有必要探索评价新生儿VitA营养状态的适宜标准。

孕妇血液中的视黄醇以视黄醇-视黄醇结合蛋白的形式透过胎盘转运至胎儿[11]。本研究发现VitA-PTR与孕晚期妇女血浆VitA水平呈非线性负相关关系(rsadj= -0.82，P<0.001)，即当母血视黄醇处于相对高浓度时，胎盘对视黄醇的转运效率降低，而当母血视黄醇处于相对低浓度时，胎盘对视黄醇的转运效率增加，以保持胎儿体内VitA水平相对稳定。此外,VitA-PTR与母血VitA水平的相关系数随脐带血VitA营养状态不同而发生变化，提示胎盘转运能力可能受到母体与子代VitA水平的双调控。动物实验发现胎盘既能将母体视黄醇转运给胎儿，亦能使胎儿视黄醇通过胎盘分泌进入母体循环[21]。胎盘VitA转运能力受母子双向调节利于维持胎儿体内VitA水平相对稳定，以保障其正常生长发育。VitA-PTR仅体现胎盘转运效率，有必要进一步收集胎盘标本并辅以动物实验，明确VitA胎盘转运和双向调控的具体机制。

本研究定量分析了孕晚期妇女和新生儿血浆VitA水平的剂量-反应关系，定性分析了孕妇VitA营养状态对新生儿VitA缺乏的影响，并探讨了胎盘转运效率在其中的可能机制，为相关后续研究和政策制定提供了数据支撑。本研究也有不足之处，样本储存时间略长，尽管在-80 ℃储存条件下，视黄醇至少在5年内保持相对稳定[22]，但不排除少量视黄醇分解的可能性。若母血和脐带血视黄醇等量分解，则不会实质影响本研究的主要结果。