猪口蹄疫病毒MFIA xTAG检测方法的建立

崔雨葳

辽宁省抚顺市现代农业及扶贫开发促进中心，辽宁抚顺 113006

1 材料与方法

1.1 病毒、毒株、载体和临床样本

猪口蹄疫病毒（FMDV）灭活抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）JXA 1 株、猪伪狂犬病（PRV）活疫苗、猪瘟（CSFV）弱毒疫苗、猪圆环病毒2 型（PCV2）灭活疫苗、细小病毒（PPV）灭活疫苗购自商用疫苗。临床样本包括：来源于2017-2019年收集到的广东省各市的水泡液、组织等样本，-80 ℃保存，临床样本共计15 份。

1.2 引物设计与修饰

设计1 组用于快速检测猪口蹄疫病毒的xTAG检测引物组，用于检测猪口蹄疫病毒的引物对是根据猪口蹄疫病毒的3D 基因的保守序列设计的；经过反复试验与筛选后，得到表1中引物序列，在上游引物的5’端通过间隔臂序列添加tag 序列，下游引物的5’端添加生物素标记[1]。

1.3 方 法

1）核酸提取。从猪场采集的水泡液、组织等样本装入离心管中加入适量灭菌的PBS，匀浆；疫苗、组织匀浆液的PBS 溶液等样品用天根核酸自动抽取仪提取RNA/DNA，操作按说明书进行。

2）质粒标准品制备。用天根的核酸自动抽取仪提取猪口蹄疫病毒的RNA/DNA 为模板，使用表1中的引物，进行RT-PCR 扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化[2]。用TaKaRa 公司的试剂盒将纯化后的cDNA 连接至pMD-19T 载体中，将连接产物转化至DH5a 感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR 鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，并对阳性重组质粒测序验证。用质粒提取试剂盒（OMEGA 公司）提取质粒，微量紫外分光光度计测定浓度与纯度，根据下面的公式计算拷贝数。拷贝数（copies/μL）=6.022×1 023（copies/moL）×DNA 浓度（g/μL）/质量MW（g/moL）。其中，MW= DNA 碱基数（bp）×660 daltons/bp，DNA 碱基数=载体序列碱基数+插入序列碱基数。

表1 猪口蹄疫病毒引物和xTAG 标签

3）xTAG 检测方法的建立。表1中上游下游引物按等比例进行混合。用FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV2 的核酸为特异性模板，分别进行单重检测。

4）PCR 扩增反应体系。2×buffer，10 μL；上、下游引物混合液，1 μL（10 μmoL/L，final conc.）；酶，1μL；ddH2O，7 μL；总体积20 μL。

5）扩增的反应程序。50 ℃30 min；94 ℃变性15 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循环35 次；72 ℃终延伸10 min。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

6）PCR 产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE）工作液杂交，包括以下步骤：包被有特异的anti-tag 序列的微球，其中anti-tag 序列能相应地与猪口蹄疫病毒引物上的tag 序列互补配对。微球购自luminex 公司，荧光编码微球号为MTAG-A029[3]。

7）荧光编码微球工作液的制备。将2 500 个/μL荧光编码微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer 稀释到1 μL 约含有125 个/种荧光编码微球。

8）SA-PE 工作液制备。将1 mg/mL SA-PE 用1×Tm Hybrdization Buffer 稀释到10 μg/μL。充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20 μL，样品孔中加入5 μL PCR 产物，背景孔中加入5 μL PCR blank 产物，再加入75 μL SA-PE 工作液，充分混匀，于金属加热器中37 ℃孵育30 min。依照检测仪Luminex 200 仪器的说明将杂交后的50 μL 上述反应液进行检测[4]。

9）最低检测阈值（cutoff 值）的确定。选取10 只健康猪组织样品（每个样品平行重复3 次），分别读取MFI 值并计算其平均值和标准差。

10）特异性试验。使用表1中的混合引物，用FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV2 作为模板进行xTAG 特异性分析检测。

11）灵敏性试验。将上述质粒标准品用Easy dilution（Takara 公司）做10 倍系列稀释，稀释至10 copies/μL 作为标准模板。利用1.3 4）中优化后的反应体系和条件测定各稀释度的荧光信号值。

12）重复性试验。对2 份10 倍系列稀释的质粒标准品1×105、1×107copies/μL 在同一次反应中进行3 次重复测定，对不同稀释度的MFI 值进行统计，计算每个样品各反应管之间的批内变异系数（CV%）；对上述样品分别进行3 次测定，计算同一样品每次测定结果之间的批间变异系数（CV%）。

13）临床样本的检测。从猪场采集的水泡液、组织等样品，用天根核酸自动抽取仪提取RNA，使用Qiagen 的RT-PCR 进行扩增，以RNA 作为模板，采用上述建立的猪口蹄疫病毒的xTAG 检测方法进行检测，扩增产物与荧光编码微球和SA-PE 杂交，在Luminex200 检测仪上读数。

2 结果与分析

2.1 质粒标准品的制备

以猪口蹄疫病毒为模板扩增得到产物大小约为208 bp，与预期目的片段大小相符。与pMD19-T载体连接构建重组阳性质粒，对重组质粒进行PCR鉴定，条带大小与预期结果相符。重组质粒的测序结果与目的基因序列同源性为100%，表明质粒标准品制备成功。

2.2 xTAG 方法的建立

最低检测阈值（cutoff 值）的确定：获得cutoff 值为389，因此将cutoff 值定为400。只有检测样品的MFI 值高于400 时，该试验数据才能进行有效分析。待测样本的分析判断：①待测样本的MFI 值＞400时，判断为阳性样本；②待测样本的MFI 值≤400时，判断为阴性，需要进行重复试验或采取其他检测方法进一步验证。

2.3 特异性试验结果

采用建立的xTAG 方法对FMDV、PRRSV、PPV、PRV、CSFV、PCV2 进行检测，结果表明引物仅能扩增出对应病原核酸片段，其他病毒均为阴性，表明建立的方法具有良好的特异性。

2.4 灵敏性试验结果

对10 倍系列稀释的质粒进行检测，结果表明，本试验建立的液相基因芯片方法检测的灵敏度可达1×102copies/μL。

2.5 重复性试验结果

通过对1×105、1×107copies/μL 2 个稀释度质粒标准品样本进行重复性检测，批内及批间重复性试验的变异系数均小于3% ，表明建立的xTAG 方法重复性好，方法稳定可靠。

2.6 xTAG 方法在临床样本检测中的应用

应用建立的xTAG 检测方法对15 份样本进行检测，5 份水泡液都为阳性，10 份组织均为阴性。

3 小 结

本试验根据猪口蹄疫病毒的3D 基因的保守序列设计了一对特异性引物，建立了扩增猪口蹄疫病毒的液相基因芯片检测方法，该方法敏感性高，可达1×102copies /μL；特异性强，对PRRSV、PRV、PPV、CSFV、PCV2 的检测结果均为阴性；批内、批间试验的变异系数都在3%以下，该方法具有很好的重复性。本试验无需电泳，避免了电泳过程中的污染。

应用建立的液相基因芯片检测技术方法，对广东某猪场送检的15 份临床样本进行了检测，检出阳性率为33.3%。本试验建立的禽猪口蹄疫病毒的液相基因芯片检测方法具有快速、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，该液相基因芯片检测方法的建立可用于猪口蹄疫病毒的临床诊断和流行病学调查，为进一步研究该病的防治具有重要意义。