改良QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法同时测定植物油中香兰素·甲基香兰素和乙基香兰

刘强欣　张虹　胡云强　闻佳钰　陈瑜　吴丹虹　何晓明

摘要 [目的]建立植物油中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的高效液相色谱-串联质谱测定方法。[方法]以QuEChERS为基础，样品经乙腈-水（80∶20，V/V）提取，采用EMR-Lipid净化，以ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分离后，在电喷雾离子源的负离子模式下，多反应监测模式采集数据，外标法分量。[结果]在10～1 000 μg/L香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素这3种化合物线性关系良好，相关系数（r）为0.993～0.998。[结论]该方法简单、准确、灵敏、快速，适用于植物油中3种香精的测定。

关键词 QuEChERS;香兰素;甲基香兰素;乙基香兰素;高效液相色谱-串联质谱法;植物油

中图分类号 TS207.3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）11-0198-04

Abstract [Objective]A liquid chromatographytandem mass spectrometric（LC-MS/MS）method was developed for the simultaneous determination of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in vegetable oils.[Method]The sample was extracted with acetonitrile-water（80∶20，V/V），cleared up by EMRLipid.The separation of target compounds were performed on an ACQUITY UPLC HSS T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）.Then the sample were ionized using Electrospray ionization （ESI），examined under multiple reaction monitoring（MRM） mode and quantified by the external standard method.[Result]The linear ranges of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin were 10-1 000 μg/L，with correlation coefficients（r） of 0.993-0.998.[Conclusion]It is simply，accurate，sensitive and quick for the detection of three essnces in vegetable oils.

Key words QuEChERS;Vanillin;Methyl vanillin;Ethyl vanillin;High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry;Vegetable oils

香蘭素、甲基香兰素和乙基香兰素是食品中常见的食用香料，其中香兰素是天然存在于咖啡、芦笋和香兰荚中，后两者是人工合成的化合物。它们是一种允许添加的食品添加剂，在糖果、饼干、糕点和饮料中被广泛应用。但有相关文献表明过量食入香精可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至会损伤肝肾[1]。植物油是由不饱和脂肪酸和甘油化合而成的化合物，广泛分布于自然界中，是从植物的果实、种子、胚芽中得到的油脂（如菜籽油、大豆油和花生油等）。我国是植物油消费大国，植物油是一种生活必需品，人们每天通过各种形式摄入植物油，随着我国改革开放和国民经济的发展，人们生活水平日渐提升，食品产品安全意识逐步提高，并且依据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定植物油脂是不得添加食用香料、香精，因此植物油中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的检测就很有意义了。

目前，对于香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色谱法[3]、液相色谱-串联质谱法[4-5]、气相色谱-质谱联用法[6-7]等。高效液相色谱-串联质谱法具有准确、高选择性和高灵敏度的特点，在食品分析领域被广泛应用。该试验采用改进Quick Easy Cheap Effective Rugged（QuEChERS）方法净化，结合高效液相色谱-串联质谱法用于植物油中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂。样品为市售植物油。甲酸、乙腈和甲醇（HPLC级，美国Thermo公司）; 增强型基质去除吸附剂（EMR-Lipid，美国Agilent公司）;十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）（天津博纳艾杰尔科技有限公司）;试验用水为Milli-Q超纯水;其他试剂均为国产分析纯试剂。香兰素（含量98.8%），美国CATO公司; 甲基香兰素（含量98.3%），上海ANPEL公司;乙基香兰素（含量99.9%），上海ANPEL公司。

1.1.2 仪器与设备。三重四级杆液相色谱/串联质谱仪（LC-MS/MS 8050，日本Shimadzu公司）;多管涡旋混合仪（DMT-2500，杭州米欧仪器有限公司）;高速冷冻离心机（ST16R，美国Thermo公司）;超纯水机（美国Millipore 公司）;超声波清洗器（KQ-500E，500 W，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制。

用甲醇分别配制香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的10 mg/L的单标储备溶液，于-18 ℃ 下避光保存。用时根据需要用空白基质提取液逐级稀释配成适当浓度的混合标准工作液。

1.2.2 样品前处理。

称取1.00 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL 80%乙腈溶液涡旋混匀，超声提取10 min， 8 000 r/min离心 3 min，移取4 mL上清液置于0.5 g EMR-Lipid 净化管中（使用前用2 mL水充分润湿活化），涡旋振荡2 min，8 000 r/min 离心3 min，转移净化液至已提前加入0.5 g氯化钠和1.0 g无水硫酸钠的10 mL离心管中，涡旋振荡2 min，8 000 r/min 离心3 min，将净化液移入10 mL离心管中，40 ℃下氮吹至干，加入1.0 mL 初始流动相涡旋溶解残留物，过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.3 色谱条件。

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;进样量3 μL;柱温35 ℃;流动相为0.1%氨水溶液（A）和甲醇（B）;流速为0.3 mL/min;流动相梯度程序见表 1。

1.2.4 质谱条件。

电喷雾离子源（ESI），温度400  ℃，毛细管电压3 000 V;扫描方式：负离子模式;雾化气流量：3.0 L/min;加热气流量：10.0 L/min;定性与定量离子对、碰撞能量等参数见表 2。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

3种化合物的化学结构式上同时具有羟基和醛基，因此分别在正、负离子模式下对浓度为1.0 mg/L化合物的标准溶液进行全扫描。结果表明，3种化合物均能产生[M+H]+以及[M-H]-的准分子离子，但在负离子模式能够提供更多的碎片信息。在此基础上，进行二级质谱扫描，并根据EU第657/2002/EC号决议中有关规定中有关质谱分析方法必须不少于4个识别点的规定，选择2对质谱响应最佳的监测离子对及相应参数作为最终质谱采集参数。

2.2 色谱条件的优化

采用负离子模式分析样品时，在流动相中加入适量的碱性物质可提高化合物的离子化效率。该试验考察了甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水这2种流动相体系在相同梯度洗脱条件下对3种化合物的分离度、灵敏度和峰型的影响。结果表明，采用甲醇-0.1%氨水作为流动相，化合物具有更好的分离效果和响应值， 3种化合物总离子流色谱图见图1。

2.3 前处理方法的优化

2.3.1 提取溶剂的优化。

香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素均属于弱极性化合物，甲醇、乙腈是常用的提取溶剂。该试验比较了甲醇、乙腈2种提取溶剂对化合物提取效率的影响。结果表明，乙腈的提取效率较好，且提取液带出的油脂杂质较少[8-12]，提取液颜色更清澈，便于后续净化。

由于植物油样品与乙腈互溶性不佳，直接用乙腈提取存在分散不够完全的现象。为改善提取效果，在提取时加入一定量水，不但可以分散样品，又提高了乙腈对于样品的渗透性，从而改善提取效率[13]。该试验进一步对体积分数为60%、70%、80%、90%乙腈溶液和纯乙腈5种提取试剂进行了比较。结果表明（图2），当提取溶剂中乙腈体积分数为80%时，提取效率最高。因此选择80%乙腈溶液作为提取溶剂。

2.3.2 提取时间的优化。

比较不同的超声时间（5、10、20、30 min）对3种化合物提取效率的影响，结果显示（图3），在超声提取10 min时可获得较好的回收率，继续增加超声时间，提取效率无明显差异。因此选择超声10 min提取样品。

2.3.3 吸附剂的优化。

植物油中主要的基质干扰为脂类物质，这些杂质的存在会干扰化合物的测定，影响方法的灵敏度、精密度和准确度。因此选择合适的吸附剂来去除杂质以降低基质效应（ME）对检测结果的影响，成为QuEChERS方法的关键。该试验为考察C18、PSA和EMR-Lipid这3种吸附剂的净化效果，分别将QuEChERS方法中常规用量0.5 g C18、PSA和EMR-Lipid净化剂分别加入到4 mL加标浓度为50 μg/kg的植物油提取液中，以ME值評价3种吸附剂的净化效果，ME=（基质加标溶液响应值/空白溶剂中加标溶液响应值）×100%。

结果表明，EMR-Lipid净化效果优于C18、PSA（图4）。这可能是与传统吸附剂C18、PSA相比，特殊聚合物基质EMR-Lipid是一种针对油脂类成分设计的增强型脂质去除净化剂，能够专门吸附长链结构脂类物质，选择吸附性好，能有效降低高脂肪含量基质对目标成分的干扰。

为确定EMR-Lipid的合适用量，该试验进一步对0.25、0.50、0.75、1.00和1.25 g EMR-Lipid的净化效果进行比较。结果表明，当EMR-Lipid用量为0.50 g时，化合物回收率均大于80%，继续增加EMR-Lipid用量，其回收率之间没有显著差异。因此最终选择0.5 g EMR-Lipid作为吸附剂的合适用量。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线与检出限。

在优化的条件下进行了方法学验证。配制系列浓度的基质匹配混合标准工作溶液，以化合物的质量浓度（X，μg/L）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。结果表明（表3），在10～1 000 μg/L 3种化合物线性关系良好，相关系数（r）为0.993～0.998。采用标准添加法进行测定，以3倍信噪比确定样品检出限（LOD），10倍信噪比确定方法定量限（LOQ），得到3 种化合物的检出限为9.2～11.4 μg/kg，定量限为30.4～37.6 μg/kg。

2.4.2 回收率与精密度。为考察该试验的可行性，向空白菜籽油、大豆油和花生油样品中添加高、中、低3个水平的混合标准溶液，每组做6个平行，结果发现（表4），在优化的试验条件下不同油品的平均回收率在72.8%～91.8%，RSD为1.6%～8.6%，准确度与精密度能满足实际分析的要求。

2.5 与国标方法的比较

香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素这3种化合物现有国标方法为BJS 201705《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定》，该国标方法中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素检出限均为30.0 μg/kg，定量限均为100.0 μg/kg。该方法检测香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的检出限明显低于上述国标方法。同时在样品前处理上，相对于国标方法，该方法对于提取溶剂、提取时间、吸附剂进行了优化，并且操作简方便、回收率高。

3 结论

该研究建立了植物油中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的高效液相色谱-串联质谱法方法，通过改良QuEChERS方法，使得香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素在植物油中的提取效率、灵敏度均显著提高，优于国标方法。该方法简单、准确、灵敏、快速，可满足植物油中的香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的快速测定要求。

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