镉铅胁迫对桑树种子萌发和幼苗生长以及重金属累积的影响

高鸿鹏　郑直　刘超　张中羽　董小龙　苏超　张敏娟

摘要 [目的]研究重金屬胁迫对桑树种子萌发及幼苗生长的影响，分析桑树幼苗对重金属的吸收和累积规律。[方法]以冀桑3号和鲁杂1号2个品种桑树种子和幼苗为材料，采用滤纸萌发法分析重金属镉、铅对2个品种桑树种子萌发的影响，采用土培盆栽法分析镉和铅对2个品种桑树幼苗生物量的影响及幼苗对镉和铅的吸收转运规律。[结果]桑树种子萌发受到镉、铅的抑制作用，并且镉和铅对胚根毒害作用更强。镉和铅元素对桑树种子胚根生长有显著抑制作用的浓度分别为114、331 mg/L;2个品种幼苗的生物量随着镉和铅处理浓度的升高而降低，冀桑3号幼苗能耐受20 mg/kg的镉胁迫和500 mg/kg的铅胁迫而不降低其生物量。2个品种桑树幼苗对镉和铅的吸收水平均随着镉、铅处理浓度的升高而升高;幼苗对镉的富集系数和转移系数分别为0.53～3.58和0.41～0.84，对铅的富集指数和转移系数分别为0.02～0.58和0.11～0.78。从2个品种的富集系数和转移系数的对比来看，冀桑3号幼苗与鲁杂1号幼苗对镉、铅的耐受能力、富集能力存在一定程度的差异，且2个品种幼苗均不能有效地将镉和铅转运至植株地上部分。[结论]该研究可为植物修复重金属污染提供一定依据，为进一步利用桑树进行土壤修复奠定一定的理论基础。

关键词 桑树;镉;铅;累积;生物量

中图分类号 Q945文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）11-0131-06

Abstract [Objective]To study the effects of heavy metal stress on seed germination，seedling growth and the heavy metals absorption and accumulation of mulberry trees.[Method]Seeds of two mulberry cultivars （Jisang No.3 and Luza No.1） were exposed to five cadmium （Cd） and lead （Pb） concentrations by using petridish method，the germination percentage and root lengths were measured.Seedlings of these two mulberry cultivars were used as materials，the heavy metal treatment was carried out by using potculture method，the biomass and heavy metal content of two mulberry cultivars were examined.[Result]The germination of mulberry seeds was inhibited by lead and cadmium treatment，cadmium and lead had stronger toxic effects on the root elongation of mulberry.The roos of mulberry seeds were significantly inhibited at concentration of 114 mg/L and 331 mg/L for cadmium and lead，respectively;at the cadmium concentration of 20 mg/kg and the lead concentration of 500 mg/kg，mulberry seedlings of Jisang No.3 grew well without reducing biomass.Both of the two mulberry cultivars absorbed more elements with increasing cadmium or lead dose.The bioconcentration factor and transfer factor for cadmium in the two mulberry seedlings ranged from 0.53 to 3.06 and from 0.41 to 0.84，respectively.The bioconcentration factor and transfer factor for lead ranged from 0.02 to 0.58 and 0.11 to 0.78，respectively.By comparing the bioconcentration factor and transfer factor of the two cultivars，we found that there was a certain degree of difference in tolerance and uptake capacity to cadmium and lead between seedlings of Jisang No.3 and Luza No.1，and the two cultivars could not effectively transport cadmium and lead from root to shoot.[Conclusion]These results provided a basis for phytoremediation of heavy metal pollution，and indicated that mulberry can be a candidate for repairing heavy metal contaminated soil.

Key words Mulberry;Cadmium;Lead;Accumulation;Biomass

随着工业化、城市化进程的加快，近年来土壤重金属污染问题日益加剧，对人体健康和社会发展造成了一定威胁[1-4]。土壤中重金属污染以镉和铅的污染面积最大、污染程度最甚[5-6]。重金属污染具有隐蔽性、不可逆和残留期长等特点，故环境中低浓度的重金属有可能通过食物链的富集而在人体内蓄积，从而破坏人体正常代谢活动，损害人体健康[7]。因此，土壤重金属污染的修复研究已迫在眉睫。

生物修复作为一种费用低、环境危害小、无二次污染的新兴技术，在土壤重金属污染治理方面具有广阔前景[8]。其中，植物修复技术通过植物固定、植物转移和植物分解来修复污染土壤和水体，已成为一种新兴的高效生物修复技术，且植物修复具有良好的社会、生态综合效益，因而易被大众接受。生物修复综合技术将是今后重金属污染土壤修复技术的主要研究方向[9-10]。当前，寻找高效、经济和适宜的修复植物已成为广泛利用植物修复技术治理土壤重金属污染的关键。目前已经发现的重金属超累积植物超过500种，然而，这些超累积植物的不足之处在于其多为草本植物，生长缓慢且生物量小[8]，从而限制了其在重金属污染土壤修复中的广泛应用。除超累积植物外，将生物量大、生长迅速且具有一定经济价值的灌木或乔木用于土壤污染修复将具有极大优势[11]。

桑树是一种在我国栽培历史悠久、地域分布广泛的经济树木，其生长速度快、耐剪伐并可适应多种不良环境，近年来已逐渐被用于生态治理[12]。该研究拟通过对重金属胁迫下桑树种子的发芽率、幼芽生长以及重金属镉、铅胁迫对桑树幼苗生物量的影响及幼苗吸收和转运重金属的规律进行分析，以期为进一步利用桑树进行土壤修复奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以冀桑3号和鲁杂1号种子和实生桑树幼苗为材料。重金属镉和铅的供源分别为氯化镉（CdCl2·2.5H2O）和硝酸铅[Pb（NO3）2]，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。育苗基质购自山东寿光天丰园艺材料厂，基质中有机物含量≥30%，育苗基质的镉、铅含量本底值分别为1.05、15.00 mg/kg。

1.2 种子萌发

将种子清洗干净，自来水浸泡过夜，选取饱满种子以75%乙醇和次氯酸钠溶液（有效氯含量为1%）对种子进行表面消毒。75%乙醇浸泡5 min，无菌水洗3次，以次氯酸钠溶液浸泡30 min，无菌水冲洗3次，最后一次浸泡5 min，吹干，置于铺有3层滤纸的培养皿中。对鲁杂1号、冀桑3号种子分别进行镉、铅胁迫处理，设置镉处理浓度为0、23、114、228、685、1 141 mg/L，设置铅处理浓度为0、331、993、1 656、2 318、2 980 mg/L，对照组添加无菌水，每皿30粒种子，3次重复处理。25 ℃恒温温室无菌培养种子，光暗周期为14/12 h。以胚芽或胚根长度达到种子长度1/2时开始每天记录种子发芽数，待发芽结束后，以数显卡尺测量根长，计算发芽率，公式如下：

发芽率=供试种子的发芽数/供试种子数×100%

1.3 幼苗种植和胁迫处理

采用基质培养方法对2个品种桑树幼苗進行重金属镉和铅胁迫耐受性试验。在育苗盆中挑选1月龄长势一致、无病虫害、生长良好的实生桑树幼苗（平均株高5 cm，平均基部茎直径1.96 mm），将其转移到盛有等质量育苗基质的37 cm×24 cm×11 cm塑料方盆中进行培养，隔天浇水1次，待幼苗稳定生长至株高约15 cm，基部茎直径约2.30 mm时，进行重金属胁迫试验。铅胁迫处理设置4个浓度梯度，使基质中铅的终浓度分别为CK，500、1 000、2 000 mg/kg，镉胁迫处理设置4个浓度梯度，使基质中镉的终浓度分别为CK，20、50、100 mg/kg，对2个品种幼苗进行4水平5重复处理。控制每盆装有相等干重的基质，计算每组重金属处理所需的重金属的量，每个处理按照不同重金属浓度配成溶液一次性浇灌基质，待水分蒸发之后搅拌均匀，再浇透水，移栽幼苗。将幼苗置于温室之中进行恒温光照培养（25～28  ℃，光暗周期为10/14 h），正常浇水及护理。重金属胁迫处理30 d后，将重金属胁迫处理的桑树幼苗从基质中取出，自来水反复冲洗后蒸馏水冲洗干净用滤纸吸干。用剪刀将根和地上部分分开，分别测量地下部分和地上部分鲜重，再将地上部分与地下部分分别装入无纺布袋中，在80 ℃烘箱中烘干直至恒重，取出样品测量干重。之后将样品取出，用研钵磨成粉末保存。

1.4 植物样品的消化及镉铅含量的测定

干粉样品采用湿法消化，称取0.200 0 g的样品于消解管中，加10 mL混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1），将消解管放入消解炉中，设置温度为100 ℃，缓慢加热，使样品充分消解，保持100 ℃ 40  min，升温到230 ℃，此时消解管中充满红棕色浓烟，保持60  min，待消解至溶液透明，呈无色或淡黄色。取下冷却至常温，45 μm微孔滤膜过滤，用超纯水定容到25  mL。采用石墨炉火焰原子法（火焰石墨炉原子吸收光谱仪，日本日立，Z-2000型）测定植物各部分的镉、铅含量[13]。

1.5 转移系数和富集系数的计算 植物将重金属从地下部分转移至地上部分的能力即为转移系数（TF）：

TF=地上部分（茎叶）平均重金属浓度/地下部分重金属浓度

植物不同部位积累重金属的能力即为生物富集系数（BCF）：

BCF=根或地上部分（茎叶）平均重金属浓度/土壤重金属终浓度

1.6 数据处理 数据处理及方差分析采用Excel 2003和SPSS16.0软件进行，柱形图用Excel 2003制作，箱式图用OriginV8.0制作。

2 结果与分析

2.1 镉和铅对桑树种子萌发和胚根伸长的影响

镉、铅对桑树种子萌发的抑制作用随着其浓度的提高而增强，高浓度重金属胁迫下，桑树种子的发芽率显著下降。与对照组相比，23 mg/L 镉处理后桑树种子的发芽率没有显著下降，随着镉浓度从114  mg/L升高到228  mg/L，鲁杂1号种子发芽率从88%降低到62%，而冀桑3号种子发芽率从88%降低到31%（图1a）。鲁杂1号和冀桑3号发芽抑制率超过50%的镉浓度分别为685、228  mg/L，说明冀桑3号种子对高浓度镉毒害的耐受性较鲁杂1号差。铅浓度低于1 656  mg/L，对鲁杂1号和冀桑3号种子的发芽率没有影响（图1b）;当铅浓度分别为2 318、2 980  mg/L时，鲁杂1号种子的发芽率分别降了5、9百分点，冀桑3号种子的发芽率分别降低了7、11百分点，说明高浓度的铅处理对桑树种子萌发的影响不显著。

随着重金属胁迫浓度的升高，桑树种子胚根长度逐渐减小，说明重金属处理对桑树胚根的伸长产生抑制作用，重金属元素对桑树种子胚根伸长的抑制作用较胚芽强，因此胚根长度更适合作为衡量桑树种子重金属伤害的指标。与对照组相比，23  mg/L 镉处理后冀桑3号和鲁杂1号种子的胚根长度分别下降至对照的49.62%和65.62%，114  mg/L镉处理后冀桑3号和鲁杂1号种子的胚根长度分别下降至对照的0.41%和1.14%（图2a和2b）。当铅处理浓度为331 mg/L时，冀桑3号和鲁杂1号种子的胚根长度分别下降至对照的51.73%和36.40%，随着铅浓度从993 mg/L升高至1 656 mg/L，冀桑3号和鲁杂1号种子胚根长度的降幅从37.74%和25.65%下降至10.31%和8.36%，当铅处理浓度为2 980  mg/L时，冀桑3号和鲁杂1号种子的胚根基本停止生长（图2c和2d）。

2.2 镉和铅对桑树幼苗生物量的影响

由表1可知，20 mg/kg镉处理使得冀桑3号幼苗地上部分和地下部分干重比对

照分别增加了63.06%和47.15%;鲁杂1号幼苗地上部分干重比对照增加了12.64%，但差

异不显著（P>0.05），而地下部分干重下降了26.96%;鲁杂1号幼苗整株生物量下降了3.91%，冀桑3号幼苗整株生物量增加了57.55%。随着镉浓度的增加，鲁杂1号幼苗与冀桑3号幼苗的生物量均有降低。当镉浓度为50 mg/kg时，鲁杂1号幼苗、冀桑3号幼苗的地上部分和地下部分干重较对照分别下降了31.50%、65.88%和21.02%、41.85%，整株生物量分别下降了46.75%和28.37% （表 1）。当镉浓度为100 mg/kg时，鲁杂1号和冀桑3号幼苗的地上和地下部分干重较对照分别下降了64.88%、69.37%和34.72%、52.31%，整株生物量分别下降了66.87%和40.87%。上述结果表明，冀桑3号幼苗对镉处理的响应呈现“低促高抑”现象，与对照生物量相比，20 mg/kg镉处理下冀桑3号幼苗生物量显著增加（P<0.05），而鲁杂1号幼苗生物量则有所下降，但无显著差异（P>0.05）;隨着镉处理浓度的升高，鲁杂1号幼苗生物量的下降幅度较冀桑3号幼苗更大，表明镉胁迫对鲁杂1号幼苗的伤害更为严重，并首先对其根部造成伤害。

由表2可知，铅处理下桑树幼苗的生物量随着铅浓度的升高而下降，500 mg/kg 铅处理使鲁杂1号幼苗的地上部分干重增加了2.29%，但无显著性差异（P>0.05），而地下部分干重下降了48.17%，且达到显著水平（P<0.05）;冀桑3号幼苗在500 mg/kg铅胁迫下，其地上部分和地下部分干重分别下降了26.80%和10.05%;鲁杂1号和冀桑3号幼苗的整株生物量分别下降了20.09%和20.80%。 当铅处理浓度从1 000 mg/kg增加到2 000 mg/kg 时，冀桑3号幼苗的地上部分干重和地下部分干重的下降比例分别从40.71% 和31.11% 增加到70.84% 和50.14%，整株生物量从37.33%下降到63.54%;鲁杂1号幼苗的地上部分和地下部分干重的下降比例分别从24.76% 和62.37%增加到54.31% 和87.53%，整株生物量从41.44%下降到69.04%。以上结果表明，500 mg/kg铅处理对桑树幼苗的生长造成了一定程度的伤害，1 000 mg/kg铅处理严重影响了桑树幼苗生长。与冀桑3号幼苗相比，鲁杂1号幼苗的根对铅处理更为敏感，随着处理浓度的升高，鲁杂1号幼苗的根受到更为严重的伤害，而在幼苗根部受到严重伤害的时候，根对水分和养分的吸收功能受到限制，进而使幼苗地上部分生长受到影响。

2.3 桑树幼苗对镉和铅的吸收和富集

随着土壤中镉浓度的升高，2个品种桑树幼苗地上部分和地下部分镉含量呈增长趋势，且存在剂量效应（表3）。当镉浓度达50 mg/kg时，冀桑3号幼苗地上、地下部分的镉含量较对照显著增加（P<0.05），而鲁杂1号幼苗地上部分镉含量显著升高（P<0.05）;当镉浓度达100 mg/kg时，鲁杂1号与冀桑3号幼苗中镉含量均有显著差异（P<0.05），且鲁杂1号的地上部分和地下部分重金属镉含量高于冀桑3号。

与对照相比，鲁杂1号和冀桑3号幼苗地上、地下部分的铅含量随着铅处理浓度的升高而增加（表4）。重金属铅处理后，2个品种桑树幼苗地下部分对于重金属的富集量要高于地上部分，表明植物的地下部分积累了大量的重金属铅，但是很难向地上部分转运。植物通过自身的防御机制限制重金属离子的跨膜运输和转移，阻止重金属往地上部分转移，从而在整体上减少植物体内重金属含量，可以有效地减轻重金属对于植物的毒害作用。

2.4 桑树幼苗对镉和铅的转移系数及富集系数

由表3可知，2个品种桑树对重金属镉的富集指数均高于0.5，并随着镉处理浓度的升高呈增加趋势，且地下部分富集指数高于地上部分。鲁杂1号对镉的富集指数为0.53～3.06，冀桑3号对镉的富集指数为0.66～1.85，说明鲁杂1号和冀桑3号富集重金属镉的能力相近。在20 mg/kg镉胁迫下，冀桑3号对镉的富集指数大于鲁杂1号;而镉浓度为100 mg/kg时，鲁杂1号对镉的富集指数大于冀桑3号，说明不同植物品种、不同部位都影响着植物对重金属的富集作用。冀桑3号对重金属镉的转移系数随着镉处理浓度的升高而降低，在镉浓度为20 mg/kg时转移系数为0.74，镉浓度为100 mg/kg时转移系数降为0.41。以上结果表明，随着镉浓度的升高，镉对桑树的毒害作用加强，而植株上部镉含量远低于地下部分，可能是植物利用自身的保护机制阻止了镉向植株地上部分的扩散。

由表4可知，鲁杂1号和冀桑3号对铅的富集系数分别为0.06～0.58、0.02～0.30。鲁杂1号和冀桑3号对铅的富集系数随着铅处理浓度的升高而降低，且地下部分富集系数高于地上部分;地上部分的富集指数平均值分别为0.11和0.10，地下部分的富集指数平均值分别为0.36和0.21。当土壤中铅浓度为500 mg/kg时2个品种对铅的富集系数达到了最大值，表明铅浓度过高对植物的毒害作用加剧，植物体内的各种转运和解毒机制被破坏，无法正常生长，这与桑树在高浓度铅胁迫下生物量的显著降低（P<0.05）相一致。

3 讨论

重金属元素对植物的伤害体现在低浓度时抑制植物生长发育，高浓度致使植物死亡，并且重金属对植物胚根的毒害作用较胚芽强。研究表明，不同种类的植物种子能够耐受的同种重金属浓度差异较大，同一类植物的重金属耐受性存在品种间差异[14-15]。4 mg/L镉胁迫下碱蓬的发芽率下降54%，而0.5 mg/L镉处理就能使其根长抑制率高于50%[16]。10 μmol/L 镉处理后甘蓝型油菜的发芽率降低3.5%，根长抑制率为15.4%;90 μmol/L 镉处理后甘蓝型油菜的发芽率降低20.7%，根长抑制率为28.0%[17]。50 mg/L镉处理后，云南松、桤木、红椿、五小叶槭种子的发芽率分别为77.3%、48.0%、29.3%、8.7%[18]。邓恩桉和直杆蓝桉在0.5 mg/kg 镉胁迫下，发芽率分别为94.1%和85.0%，根长抑制率分别为18.6%和18.7%，而本沁桉、巨桉的发芽率分别为105%和95%，根长抑制率分别为5.9%和33.3%，4个品种桉树之间有显著差异[19]。陈露等[20]分析了10个桑树品种对镉胁迫的耐受性，结果表明50 mg/L镉处理下，镉耐受型品种桂桑6号的发芽率为74.5%，耐受性居中的品种桂桑特优12号和69851的发芽率分别为44.0%和48.5%，而鎘敏感品种沙2×伦109的发芽率仅为4.0%。与龙葵和桉树相比，相同根长抑制率下，桑树种子能够耐受的镉浓度较高，镉对甘蓝型油菜发芽率的抑制作用较桑树强，对胚根伸长的抑制作用较桑树弱。文献报道，能够使种子根长抑制率高于50%的铅浓度分别为500 mg/L （麻疯树、玉米）[21-22]、300 mg/L（毛竹）[23]、260 mg/L （小白菜）[24]、1.5 mmol/L（小麦）[25]。桑树种子对铅的耐受性较麻疯树、小麦和玉米弱，与毛竹相当，较小白菜强。与已报道的植物相比，桑树种子对2种重金属元素的耐受性较强，具有作为重金属污染修复植物的潜力。

土壤重金属污染是亟待解决的环境问题，土壤的镉、铅污染问题尤为严峻，因此，分析植物重金属吸收特性，筛选适宜的植物对重金属污染土壤进行修复是最佳的选择[26]。植物生物量可以作为生长在重金属污染土壤里植物健康的一个标志，高生物量、强耐受性和积累能力强的作物在植物修复中具有广阔的前景[11，27-29]。在现有高生物量植物中，不降低其生物量而提高重金属的积累是最为可行的策略，成为研究的热点。饲料桑品种桂桑优系列和粤桑优系列的一年生树苗，其地上部分干重可达18 900 kg/hm2;四年生强桑1号树苗地上部分鲜重可达34 425 kg/hm2[30-31]。因此，桑树作为一种生长快速的经济树木，完全满足高生物量植物的条件。

转移系数大于1被认为是重金属超累积植物的标志，而富集系数和转移系数均大于1的植物，即地上部分重金属含量高于地下部分重金属含量且高于土壤重金属含量的植物才具有修复重金属污染的价值[32]。2个品种桑树幼苗地上部分和地下部分对镉和铅的富集系数随着镉、铅处理浓度的升高而降低，2个品种桑树幼苗地下部分比地上部分富集系数更高，说明桑树幼苗对重金属镉、铅有一定的吸收能力，且根部富集能力更强。鲁杂1号和冀桑3号对重金属镉的转移系数为0.23～0.84，对重金属铅的转移系数为0.11～0.78，这说明桑树幼苗将镉、铅转移至地上部分的能力较弱。综上所述，2个桑树品种幼苗对镉、铅具有较强的耐受性和吸收能力，且2种重金属元素均不能被有效转运至植株地上部分，鲁杂1号和冀桑3号幼苗在不同浓度的重金属镉和铅处理下，其吸收和转运重金属的能力有不同程度的差异。

4 结论

大型木本植物生物量大，寿命长，易护理，且一般的乔木绿化树种不会进入食物链，也避免了重金属污染，尤其是树干部位，可长期稳固并储存大量重金属元素，因此成为较为理想的重金属修复树种[26]。根据中华人民共和国国家标准土壤环境质量标准（GB15618—1995）三级限值，保障农林生产和植物正常生长的土壤镉、铅含量临界值分别为1.0、500 mg/kg。而桑树2月龄幼苗对重金属镉的吸收能力达到土壤三级污染限值的20倍，对铅的吸收水平也能达到土壤三级污染限值，作为一个大生物量植物，桑树在重金属镉、铅污染土壤的治理方面有一定的应用潜力。几千年来，桑树主要作为家蚕饲料而存在，随着桑产业的振兴，桑树的生态价值受到广泛关注，除此之外，桑树的食用和药用价值也不容忽视，因此，桑树作为重金属污染治理树种时，要谨慎处理并避免食用、药用方向的产品开发，以免其进入食物链，损害人体健康。