杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠Nrf2/HO-1 氧化应激信号通路的影响

许碧琪，戴燕青，傅倩云，梁 韬

（1.浙江大学医学院附属儿童医院，杭州 310000；2.广西医科大学附属口腔医院，南宁 530021）

糖尿病是导致终末期肾病发生的重要危险因素。糖尿病肾病（DN）是患者在长期慢性高血糖环境下出现的以肾小球滤过率异常和持续出现尿蛋白为特征的微血管并发症[1]。目前多采用控制血糖、调节血脂、抗氧化、血管紧张素转化酶抑制剂和钙拮抗剂等综合治疗，但仍难以阻止肾功能的持续减退[2-3]。有研究发现，Nrf2/HO-1 信号通路的激活可减少肾脏组织的氧化应激，保护肾组织，延缓糖尿病肾病的进展[4]。杜仲黄酮为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）的干燥树皮中提取的主要成分。有研究表明，杜仲及杜仲黄酮可降低糖尿病小鼠空腹血糖，并有良好的抗氧化作用[5-7]，但其具体的相关作用机制尚未清楚。因此，本研究基于前期预实验结果，采用低浓度链脲佐菌素及高脂高糖诱导的糖尿病肾病小鼠体内模型探讨杜仲黄酮是否能通过调节氧化应激信号通路Nrf2/HO-1 的表达来达到抗氧化作用，以期为糖尿病肾病的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级，体质量18～22 g 的昆明种雄性小鼠，购自浙江大学实验动物中心，合格证号：SCXK（浙）2013-0023。小鼠饲养于通风良好的环境，室温18～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h 光照昼夜循环。实验开始前小鼠进行适应性喂养1 周。

1.2 药品与试剂 缬沙坦片（北京京丰制药有限公司，批号：180113）；链脲佐菌素（美国Sigma 公司，批号：B1863）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20181123）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20181030）；丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：20181117）；预染蛋白Marker（西安润德生物技术有限公司，批号：QE19514）；Nrf2、HO-1 蛋白抗体（武汉博士德有限公司，批号：2891904）；HRP 标记的兔抗羊IgG 抗体（Santa Cruz Biotechnology，批号：CV20190425）；多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，批号：SC-1903）。

1.3 杜仲黄酮提取 采用醇提取法提取杜仲黄酮。首先将干燥杜仲进行充分粉碎，粉碎药材置于容器中采用70%乙醇（药材:70%乙醇=1:15），在80 ℃条件下加热回流提取2 h，连续提取3 次。将提取液进行过滤浓缩，最后可获得干燥杜仲黄酮提取物。

2 方法

2.1 糖尿病模型建立和给药[8]取60 只昆明种雄性小鼠，链脲佐菌素采用冷藏枸橼酸缓冲液现配现用，存放于冷藏避光环境中，低浓度链脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）尾静脉注射入小鼠体内，每天注射1 次，连续注射3 d。末次注射72 h 后检测空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L 为糖尿病模型，将糖尿病模型小鼠继续给药高脂高糖饮食60 d 后，检验小鼠尿液，尿蛋白阳性小鼠视为糖尿病肾病模型成功。并另取10 只昆明小鼠作为空白对照。糖尿病肾病小鼠随机分为模型对照组、缬沙坦对照组[20 mg/（kg·d）]、杜仲黄酮低、高剂量组[80、160 mg/（kg·d）]。各组小鼠灌胃给予相应药物，模型组和空白组小鼠给予等量生理盐水，连续给药60 d。

2.2 指标测定 末次给药后2 h，检测小鼠空腹血糖。并收集24 h 尿液，取其全血离心获得血清标本，摘取肾脏组织。血清及肾脏组织储存于-80 ℃环境中。其中血清用于检测小鼠肾功能指标血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），尿液用于检测尿蛋白，肾功能指标检测采用全自动生化分析仪进行测定。部分肾脏组织进行匀浆，采用试剂盒检测SOD 活性和MDA 含量，部分肾脏组织采用Western blotting 检测Nrf2 和HO-1 蛋白表达情况。

2.3 Western blotting 检测相关蛋白表达[9]向肾组织中加入RIPA裂解液，放入高通量组织研磨器中进行研磨，冰水上静置1 h 后，4 ℃温度下，以1.2×104r/min 转速离心10 min。取上清进行BCA 蛋白定量、煮蛋白。配制10% SDS-PAGE 凝胶，经过上样、电泳、转膜、封闭后，进行剪膜，加入特异性一抗，4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜后，加入与一抗对应来源的二抗室温慢摇1 h，再用TBST 洗，用ECL 发光液进行显色，化学发光成像仪曝光。Image J 进行灰度分析。

3 结果

3.1 各组小鼠血糖水平 结果见表1。

表1 杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠空腹血糖的影响

3.2 各组小鼠肾功能指标变化 结果见表2。

表2 杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠血清肾功能指标的影响

3.3 各组小鼠肾脏氧化应激水平 结果见表3。

表3 杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠肾脏氧化应激功能的影响

3.4 杜仲黄酮对各组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响 结果见表4 和图1。

表4 杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠Nrf2、HO-1蛋白表达的影响

图1 杜仲黄酮对各组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1蛋白表达的影响

4 讨论

氧化失衡是糖尿病肾病的重要病理机制。在糖尿病患者长期高糖内环境下，氧化应激通过蛋白激酶C途径和多元醇等途径激发晚期糖基化终末产物的积聚，引起肾小球超滤过、系膜扩张、基底膜增厚和内皮细胞紊乱，继而诱发糖尿病肾病[10-11]。Nrf2 被称为“多器官保护器”，其抗氧化反应元件途径激活可保护各细胞和组织器官免受氧化应激的毒性损害[12-13]。

Nrf2 属于碱性亮氨酸拉链家族中的一种核转录因子。广泛存在于心脏、肺、肝、心肌和肾脏组织器官中。可通过诱导基因编码抗氧化酶起到抗炎、抗氧化作用[14]。正常状态下Nrf2 保持低转录水平，Nrf2 的活性依赖于锌指样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）负性调节。在氧化应激条件下，Keap1 结构域中的半胱氨酸残基被修饰进而构象发生变化，促使Nrf2 的结合位点发生解联，进而推动Nrf2与抗氧化元件（ARE）结合，激活靶基因，最后调控II 相解毒酶和抗氧化酶HO-1、SOD 和过氧化氢酶（CAT）等的活性及MDA 的表达，发挥抗氧化应激作用[15-16]，从而提高机体抗氧化应激的能力。

研究发现，糖尿病患者体内氧化失衡伴随着Nrf2活性降低，推测Nrf2 介导氧化应激水平的升高。有报道称，Nrf2 敲除的糖尿病肾病小鼠中ROS 大量积聚，造成肾损害[17]。Chen F 等人也发现糖尿病肾病大鼠中胶原形成和肾间质纤维化可被柚皮苷所改善，其机制与激活Nrf2 有关。Nrf2 已被视为治疗糖尿病肾病的潜在靶点[18]。抗氧化酶HO-1 是Nrf2 的下游蛋白，是血红素降解中的关键酶，可催化血红蛋白降解产生胆绿素和CO 等产物，该产物能有效降低炎症反应和氧化应激损伤，对细胞起保护作用[19-20]。这些研究表明，诱导激活Nrf2/HO-1 通路可减少氧化应激对肾脏的损伤。

杜仲黄酮是杜仲科植物杜仲的干燥树皮中提取的主要成分。随着对杜仲有效成分的深入研究发现，杜仲有较强的抗氧化活性和降血糖等作用，而杜仲提取物中含有大量黄酮类物质。故本研究探讨杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠氧化应激信号通路的影响。研究结果发现，糖尿病肾病小鼠经杜仲黄酮干预后，血糖明显下降，血清肾功能指标有所改善，还伴随有肾脏组织SOD 活性升高，MDA 摩尔浓度降低。这提示我们，杜仲黄酮可改善糖尿病肾病小鼠体内的氧化应激状态。随着深入研究发现，杜仲黄酮可激活氧化应激相关通路Nrf2 和HO-1 蛋白表达。

综上所述，杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用可能与其激活Nrf2 通路，上调下游因子HO-1表达，提高机体抗氧化的能力，进而降低肾脏组织中氧化应激损伤，而起到肾脏保护作用。