胡桃醌对小鼠SH-SY5Y 神经母细胞瘤干预后相关差异基因表达变化及通路分析

李庆杰，王若汗，冯佳亮，张 行，王法宇，连树林*

（1.长春中医药大学附属医院，长春 130021；2.长春工业大学化学与生命科学学院，长春 130012；3.北京医药集团职工大学中药系，北京 100079）

胡桃楸是民间习用传统中药，含有醌类及苷、黄酮类、鞣质类及三萜类等化学物质，并具有较强的抗肿瘤、抗氧化、抗菌和镇痛等作用[1]。其中胡桃醌是胡桃楸的重要活性物质，胡桃醌属于萘醌类化合物，萘醌类药物很早就应有于癌症、胃病、心血管疾病等多种疾病的治疗[2-3]。WEN 等[4]通过实验发现，胡桃醌具有抗癌的作用，可以降低大鼠小肠癌症的发病率。左瑞庭等[5]通过实验发现，胡桃醌可通过调节Akt 磷酸化来调控p21 表达，进而调节A-FLSs 增殖和凋亡过程。本文以小鼠SH-SY5Y 神经母细胞瘤为研究对象，采用转录组学技术，对胡桃醌干预后的差异基因表达情况进行分析，旨在探讨胡桃醌抗肿瘤机制，为胡桃醌抗肿瘤新药的开发奠定基础。

1 实验材料

胡桃醌（由青龙衣中分离纯化得到，经HPLC 检测纯度达96%以上）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640 培养基（Invitrogen 公司）；胰酶（Invitrogen 公司）；Na2HPO4·H2O，KH2PO4，NaCl，KCl，二甲基亚砜（DMSO）等（北京化工厂，分析纯）；CCK8 试剂盒（Sigma 公司）。SHSY5Y 小鼠神经母细胞瘤，由长春中医药大学附属医院实验研究中心分子生物学实验室提供。INFINITE M200 酶标仪（瑞士TECAN），IX71 倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS），MILI Q 超纯水器（美国MILLIPORE），二氧化碳培养箱（美国 THERMO），SW-CJ-1F 超净台（上海博迅实业有限公司），LD5-2B 离心机（北京雷勃尔离心机有限公司），BCD-215TD GA 冰箱（海尔集团），BSA224S 电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，北京），LDZX-30KBS 型蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械有限公司）高效液相色谱仪LC-20AT（日本岛津）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 SH-SY5Y 小鼠神经母细胞瘤细胞培养于含10% 胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）的DMEM 培养基中，37 ℃，饱和湿度，5% CO2培养。每周更换培养基3 次，0.125%胰蛋白酶工作液消化分散细胞，进行传代培养。

2.2 胡桃醌样品溶液的制备 准确称取胡桃醌样品10 mg，加入PBS 2 mL，超声处理（功率100 W，频率50 KHz）10 min，0.22 μm 滤膜滤过除菌，制成5 mg/mL样品储备液，低温保存，用前以培养液稀释至所需浓度。

2.3 CCK8 法测定细胞存活率 将处于对数生长期的SH-SY5Y 细胞以7×104的浓度接种至96 孔板，每孔100 μL 培养液，37 ℃饱和湿度，5% CO2培养24 h，空白组加入培养液100 μL，对照组加入HCPT 母液100 μL 样品孔加入胡桃醌溶液100 μL 使终浓度为1.5、3、6、12.5、25、50、100、200、300、400 μg/mL，每个浓度设3 个复孔。置培养箱中培养24 h 后，加入CCK8 溶液10 μL，继续培养2 h，取出培养板，酶标仪450 nm 测定各孔吸收值A。

细胞存活率=（A样品-A空白）/（A对照-A空白）×100%。

2.4 Westem-blot 方法 SH-SY5Y 细胞采用Novagen公司的Cytobnster 提取细胞总蛋白，提取蛋白经10%SD S-PAGE 分离胶和5%浓缩胶分离后，通过湿转的方法将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜以含5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭2 h，加入相应一抗4 ℃旋转孵育过夜。次日采用0.1% TBST 洗膜3次，5 min/次，加入山羊抗兔/鼠的HRP 标记二抗，室温旋转孵育1 h；0.1% TBST 洗膜3 次，5 min/次；硝酸纤维素膜以Supersignal WestFem 化学发光底物对条带进行显色。Actiti 作为内参对照。所有实验至少重复3 次。

2.5 RT-PCR 检测p53 mRNA 表达水平 按试剂盒说明提取总RNA，RT-PCR 按说明书进行，扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR 产物用含0.5 mg/L 溴化乙锭的15 g/L 琼脂糖凝胶电泳进行，最后用凝胶成像系统Quan-tity one 软件分析结果，p53 与GAPDH 条带的相对含量比值表示。GAPDH，p53 的引物及扩增片段长度见表1。

表1 PCR 引物序列和产物长度

2.6 统计学方法 采用Graphpad 软件进行数据分析。多组数据间比较采用Anova 检验。

3 结果

3.1 胡桃醌对SH-SY5Y 细胞存活率的影响 胡桃醌对SH-SY5Y 细胞活性具有明显的抑制效果，且呈剂量依赖性，随着胡桃醌浓度的升高，对细胞活性的抑制效果增强，浓度在25 μg/mL时细胞存活率明显下降，且在胡桃醌浓度达到200 μg/mL 时，细胞存活率接近50%，且组间差异有统计学意义（P＜0.05），因此选择25、50、100、200 μg/mL 浓度进行后期实验。见表2。

表2 胡桃醌不同浓度（μg/mL）对SH-SY5Y 细胞存活率的影响（，n=3） %

表2 胡桃醌不同浓度（μg/mL）对SH-SY5Y 细胞存活率的影响（，n=3） %

3.2 转录组学技术筛选差异表达基因及KEGG 通路分析 差异表达基因的鉴定采用 R with edgeR package；当qvalue ＜0.05，定为差异表达基因。logFC 为差异倍数的log2 转换值（=1 时表示2 的+1次方，表示该基因在处理vs 对照相比，上调了2 倍）。通过处理组与对照组分析，共找到821 个显著性差异的基因。根据研究目的通过KEGG 注释，找到p53信号通路。p53 基因是人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为53kDa 的蛋白质，命名为p53。p53 蛋白由393 个氨基酸组成，具有特异的转录激活作用。p53 是一种肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。由这种基因编码的蛋白质（protein）是一种转录因子（transcriptional factor），其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向p53 蛋白发送。关于是否开始细胞分裂就由这个蛋白决定。如果这个细胞受损，又不能得到修复，则p53 蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53 缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。像所有其他肿瘤抑制因子一样，p53 基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。细胞中抑制癌变的基因“p53”会判断DNA 变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA 变异较大，“p53”就诱导细胞凋亡。p53 是重要的肿瘤抑制基因。

3.3 p53 信号通路中p53 蛋白表达情况分析 Western-blot 结果所示，与对照组相比，SHSY5Y 细胞凋亡相关基因p53 蛋白表达水平在加入胡桃醌作用后显著上调，且与胡桃醌浓度呈剂量依赖关系，其表达量随着胡桃醌浓度的升高而升高，组间差异显著（P＜0.05）。见图2，表3。

3.4 胡桃醌对SH-SY5Y 细胞p53 mRNA 表达的影响 经RT-PCR 方法检测p53 mRNA 表达变化，不同浓度胡桃醌诱导SH-SY5Y 细胞凋亡后p53 基因mRNA表达水平明显增强，且与胡桃醌浓度呈剂量依赖关系，其表达量随着胡桃醌浓度的升高而升高，组间差异显著（P＜0.05）。结果见表4。

图2 p53 基因蛋白表达水平检测结果

表3 胡桃醌对SH-SY5Y 细胞p53 表达影响（，n =3） %

表3 胡桃醌对SH-SY5Y 细胞p53 表达影响（，n =3） %

表4 胡桃醌对SH-SY5Y 细胞p53 mRNA 表达影响（，n =3） %

表4 胡桃醌对SH-SY5Y 细胞p53 mRNA 表达影响（，n =3） %

4 讨论

细胞凋亡是由多个信号通路调控的一个程序性细胞死亡过程[6-7]。在多数细胞类型中，p53 是重要的细胞凋亡调节因子，p53 基因介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，与细胞凋亡密切相关[8-9]。肿瘤抑制因子p53 在刺激下可调节细胞周期或细胞凋亡，促进p53 转录促凋亡基因，从而引起细胞凋亡。胡桃醌具有一定的抗肿瘤活性[10-11]，可能与上调p53mRNA 及p53 的表达有关。p53 可以转录活化许多靶基因，如p21，Bax，Bid，Puma 等，p53 也通过转录非依赖的形式来调节细胞凋亡，并能够直接激活Bax，诱导Bax 寡聚[12-13]。胡桃醌可抑制人乳腺癌MCF-7 细胞的增殖。该研究证明了细胞中自由基的提升与胡桃醌有关，并且在胡桃醌诱导下破坏线粒体膜结构从而引起caspase 活化，最终导致细胞凋亡[14-15]。另外，p53 能够将Bax 从Bax-Bcl 的复合物中置换出来。在本实验中，我们分别应用RT-PCR 和Western-blot 方法检测了p53mRNA及p53 表达水平，分析结果显示，胡桃醌能明显上调p53 mRNA 及p53 的表达，诱导细胞凋亡[16-18]。

综述所述，本研究结果证实了胡桃醌导致SHSY5Y 细胞凋亡的机制可能是诱导细胞凋亡水平而发挥的，与调节凋亡相关基因p53 表达相关。