早期应用黄连解毒汤对多发性脑梗死动物模型认知功能及Notch 信号通道的影响

姜海伟 ，笱玉兰，邵 卫，陈国华*，罗利俊，王俊力,，高 炎

（1.湖北中医药大学，武汉 430065；2.武汉市中西医结合医院，武汉 430022）

卒中后认知障碍是目前卒中诊疗的研究热点之一。王永炎院士提出中风“毒损脑络”的学术观点[1]，同时认为“毒损脑络”是卒中后痴呆的重要致病病机[2]。从卒中发生到卒中后认知障碍出现，“毒”邪的产生一般在中风发生前或发生时已经出现，尽早干预“毒邪”对防治卒中后认知障碍有重要的意义。本研究通过实验方法，以黄连解毒汤为解毒代表方，采用造模后24 h 和造模后7 d 的不同时段给药，观察其对实验大鼠行为学、大脑皮层Notch 信号通路的影响，综合评价不同时段给药对大鼠行为学的影响及作用机制，进而明确早期采用黄连解毒汤干预能否减少卒中后认知障碍的发生，同时了解解毒治疗的应用时机问题。

1 材料与方法

1.1 实验材料 采用SPF 级SD 大鼠60 只，体质量（250±30）g，购买于湖北省宜昌大学医学院动物中心。SYXK（鄂）2017-0067。温度：21～25 ℃，日温差：±1 ℃，湿度：50%～70%，普通饲料喂养。苏木素染液，伊红染液由谷歌生物提供。EDTA（pH 值8.0）抗原修复液、G1206、EDTA（pH 值9.0）抗原修复液、柠檬酸（pH 值6.0）抗原修复液由Servicebio 提供。Notch1 多克隆抗体、Hes1 多克隆抗体、VEGF 多克隆抗体、Stat3 多克隆抗体由Servicebio 提供。脱水机、包埋机，武汉俊杰电子有限公司。病理切片机，上海徕卡仪器有限公司提供，掌上离心机由Servicebio提供，成像系统，由日本Nikon 提供。酶标检测仪，由Rayto 提供。Morris 水迷宫视频检测仪由湖北中医药大学中医药实验室提供。黄连解毒汤：由黄连、黄芩、黄柏、栀子按 3:2:2:3 比例混合，加10 倍量水，煎煮1 h，共煎3 次。滤液合并，离心后浓缩干燥即得，收率为 20%（含黄芩苷 58.39 mg/g，HPLC 测定）。其提取物由武汉市中西医结合医院制剂中心提供,课题组采用 HPLC 法测定黄连解毒汤提取物中黄芩苷含量的方法作为质控标准。

1.3 动物造模方法 采用多发性脑梗死动物模型[3]。血栓制备：同种SD 大鼠经颈动脉采血，干燥研碎，制成血栓栓子，按1 mg 栓子加0.9%氯化钠注射液0.3 mL 比例，摇匀制备血栓悬液。造模：取10%水合氯醛腹腔麻醉，颈部正中切开皮肤，分离肌肉筋膜等组织，可看到颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，取止血夹暂时夹闭颈总动脉，取1 mL注射器吸入血栓悬液，于颈外动脉逆行注入血栓悬液0.3 mL，推注同时谨慎开放颈总动脉，使血栓可通过颈内动脉的血流进入颅内各动脉，从而造成多发性脑梗死，然后结扎颈外动脉注射口近端及远端,缝合皮肤。术后每鼠肌肉注射青霉素10 万U，连续注射4 d。假手术组于颈部正中切开皮肤后，仅分离出颈总动脉后，不结扎、不剪断，暴露5 min 直接缝合皮肤。造模成功评估：使用mNSS评分表对大鼠进行综合评定，内容包括肌力、意识、肌张力、感觉、反射、共济运动。评分大于2 分以上为造模成功。造模结果：根据神经功能评分结果及存活情况，最后入选情况为：假手术组11 只，7 d 模型对照组10只，24 h模型对照组11只，7 d黄连解毒汤10只，24 h 黄连解毒汤11 只。其中假手术对照组不予以处理；24 h 模型对照组及7 d 模型对照组，在造模成功后24 h及7 d 给予等量溶剂，0.5% 羧甲基纤维素钠溶液 1 mL/（100 g·d），连续给药 1 个月；24 h 及7 d 黄连解毒汤组，在造模成功后24 h 及7 d 予以中剂量黄连解毒汤433 mg/（kg·d）灌胃[4]。

1.5 大鼠脑组织取材 按照实验安排，给药 28 d 并完成水迷宫实验后，从每组动物中各随机选取4只大鼠，麻醉后将其固定、开胸，将灌注针头从大鼠心尖部进针，经左心室插入升主动脉，剪开右心耳，缓慢注入肝素化生理盐水约200 mL，可见右心耳处流出清澈液体，再灌注4%多聚甲醛约250 mL，灌注期间可见大鼠四肢抽搐，暴露的肝脏组织逐渐变硬变白，待抽搐停止时停止灌注，断头后将整块脑组织翘起，取出后剥离硬脑膜，将脑组织置于4%多聚甲醛固定[5]。其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100 g），于枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀，剪开顶骨，用止血钳分离两边顶骨，剪断视神经后用剪刀探到颅底，将整块脑组织翘起。将脑组织置于冰块上，于5 min 内谨慎分离出大脑皮层组织和海马组织。分离后于液氮中迅速冷冻，取出后置于-80℃冰箱保存[6]。

1.4 指标检测及方法

1.4.1 实验大鼠行为学检测 Morris 水迷宫实验[7]各组大鼠喂药28 d 后进行。Morris 水迷宫主要包括定位航行实验：先连续训练4 d，大鼠在120 s 内爬上隐蔽平台，并停留3 s 以上，此为逃避潜伏期。如果120 s未能找到平台，将其引导到平台，熟悉10 s后撤离大鼠。第5 天，从平台所在象限对角象限作为入水点，作为最后的游泳结果，电脑软件可记录逃避潜伏期时间和运行轨迹。空间探索实验：同样在实验第5 天，撤去水中的隐蔽平台，取原平台的对角象限作为入水点，将大鼠放入水中游泳，电脑软件可观察并记录120 s 内大鼠穿过原平台区域的次数。

1.4.2 HE 染色检测大鼠脑皮质梗死区及梗死周围区细胞显微结构 随机将组织从4%多聚甲醛固定液取出进行脱水。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋并贴上对应的标签。冷却后切片，脱蜡，伊红染液中染色1～3 min。再进行乙醇脱水封片，从二甲苯取出切片晾干，采用中性树胶封片[8]。显微镜下观察分析。

1.4.3 Western blot 检测大鼠皮质中 Notch 信号通道Notch1 和 Hes1 蛋白及Stat3 蛋白、血管内皮生长因子VEGF蛋白含量 大鼠新鲜脑组织取梗死侧大脑皮层，充分裂解，用BCA 试剂盒进行蛋白定量并计算上样量，行蛋白SDS-PAGE 电泳，转膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），将 Notch1、Hes1 以及Stat3、VEGF、β-actin一抗用抗体稀释液稀释后进行膜孵育，置于条件为4 ℃的摇床中过夜。第二天用TBST 液洗涤3 次，加入稀释过生物辣根过氧化酶 H R P 标记的二抗，室温下孵育 2 h，随后用 ECL 液进行显影，并用Image（美国BIO-R AD 公司）的图像处理软件进行处理，测定各样本灰度值[10]。

1.6 统计学方法 使用 SPSS 19.0 统计分析软件进行数据的统计学分析。实验数据均采用均数 ± 标准差（）表 示，各组之间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学检测结果

2.1.1 定位航行实验结果 见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期测定结果（） s

表1 各组大鼠逃避潜伏期测定结果（） s

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与7 d 模型对照组比较，△P＜0.05；与7 d 黄连解毒汤比较，▲P ＜0.05；与24 h 模型对照组比较，□P ＜0.05

2.1.2 空间探索实验结果 见表2。

表2 各组大鼠120 s 内通过平台次数（）

表2 各组大鼠120 s 内通过平台次数（）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与7 d 模型对照组比较，△P＜0.05；与7 d 黄连解毒汤比较，▲P ＜0.05，与24 h 模型对照组比较，□P ＜0.05

2.2 各组大鼠HE 染色病理结果 各模型组皮质梗死区脑细胞增大，结构欠清，细胞核偏居一侧，部分神经元出现死亡。梗死周围区细胞大小居中，细胞核居中饱满，24 h 黄连解毒汤组可见梗死区细胞核缩小，存活细胞密度高，胞浆着色与梗死周围区其他模型组相比相对差异较小，其余各模型组差异不明显。假手术组未见明显梗死区域及梗死细胞。见图1。

图1 各组大鼠梗死区及梗死周围区HE 染色病理结果

2.3 对各组大鼠皮层中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF蛋白的影响 7 d 及24 h 模型对照组大鼠脑组织皮层中 Notch1、Hes1、Stat3 蛋白表达高于假手术组（P＜0.05）；7 d 及24 h 黄连解毒汤组与假手术、7 d及24 h 对照模型组比较，Notch1、Hes1、Stat3 蛋白表达显著下降（P＜0.05）。24 h 黄连解毒汤组和7 d 黄连解毒汤组对比，Hes1 蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、图4。

图3 各组大鼠皮层中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF 蛋白表达情况

图4 各组大鼠皮层中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF 蛋白表达灰度值对比分析

3 讨论

中医络病学将络脉分为“气络”和“脉络”。“气络”与“神经—免疫—内分泌”有关，“脉络”则与微循环及血管再生相关。脑络是为络脉的一部分[11]。一般认为，颅脑内细胞及分子信号通道、神经传导、神经突触连接、神经递质、神经免疫等均属脑之“气络”范畴，而脑内侧枝循环、血管再生相关的因子应属“脉络”的范畴。广义的毒邪则包含虚、气、血、痰、瘀、风等病理因素均参与了“毒”邪产生过程[12]，目前认为，西医的“缺血级联反应”为“毒损脑络”病机提供了一定的现代生物学的依据[13]。本研究采用多发性脑梗死动物模型，有研究表明多发性脑梗死动物模型与多发性脑梗死痴呆模型造模方法相同，多发性脑梗死动物模型大鼠空间辨别能力下降，近期记忆减退，学习获得能力及保持能力均有下降[14]，体内实验表明，中剂量黄连解毒汤即可显著增强全脑缺血模型小鼠对新奇物体的分辨能力，并提高小鼠海马CA1 区的功能神经元细胞的密度[15]。同时研究还表明，黄连解毒汤提取物具有抗自由基、提高乙酰胆碱含量、改善脑血流量，对血管性痴呆具有一定的治疗作用[16]。

本研究中我们从“气络”的角度研究了与卒中后认知障碍相关 Notch 信号通道。结果表明，缺血性卒中可以激活Notch 信号通道。在体实验表明，通过抑制Notch 信号通路，减少缺氧脑组织中TLR4、MyD88、TNF 等因子的表达，减少NF-kB 的表达和转位，从而减轻大脑神经元的炎性损伤[17]。体外实验表明，N9 细胞可表达Notch 信号通路受体Notch1，及配体Jagged2、Dll-1、Dll-4 及下游基因Hes1、Hes5，Notch信号通路参与调控小胶质细胞的极化。Notch 信号通路对小胶质细胞的调控效应，有可能因被“记忆”而长期存在[18]。本研究表明，黄连解毒汤能够在一定程度上抑制Notch 信号通路的激活，改善卒中后认知功能。24 h 黄连解毒汤组逃避潜伏期及空间检测能力明显优于7 d 黄连解毒汤组。说明尽早应用“解毒”药物，尽快抑制小胶质细胞的极化，对改善其认知功能有重要的意义。同时，JAK/STAT3 信号通路同样是一个参与缺血再灌注损伤后的关键炎性途径，与记忆功能有着重要的关系[19]，一旦发生脑缺血损伤，JAK2-STAT3信号通路可被激活，STAT3 活化后促使LTD 增加，导致LTP 和LTD 的平衡发生失调，最终导致突触可塑性下降。实验表明，通过抑制JAK2 磷酸化，从而阻滞STAT3 活化并阻滞STAT3 的释放可促使LTD 减少，进而使LTP 和LTD 保持动态平衡，改善实验大鼠的空间记忆损害[20]。该研究表明，黄连解毒汤同样能抑制STAT3 的活化。

在“脉络”方面，我们研究了黄连解毒汤对于皮层区梗死周围脑血管新生方面的作用，VEGF 在血管新生中发挥着极为重要的作用。VEGF 表达增加最早在梗死发生3 h 后即可检测到，可一直持续到3 d 或7 d[21]。本实验发现，即使造模28 d 后，各模型组的VEGF 表达仍高于假手术组，但治疗组及对照组与假手术组间对比未见显著性差异。一方面考虑与每组检测样本量偏少有关，同时也与梗死后间隔时间较长有关。血管内皮细胞分化尖端细胞和茎细胞受 VEGF 和Notch 信号通路的共同调节，VEGF 是血管新生的正反馈调节因素，而通过诱导配体Dll4 的表达而启动 Notch信号通道则作为负反馈调节因素，可有效预防过量血管的形成，二者的相互作用，可使血管保持在合理的比例内并发挥其功能[6,22]。由于本研究是基于认知障碍而设计，其相关蛋白及信号通道为治疗后28 d 的结果，尚难以说明梗死早期阶段黄连解毒汤对VEGF 的作用及Notch 信号通道的影响作用如何，这也为本研究的进一步深入提供了方向。

通过本研究我们可以看到早期采用黄连解毒汤可以改善模型大鼠的行为学，在一定程度上是通过抑制Notch 及STAT3 信号通路，减少其梗死区周围的神经元凋亡来实现的。研究结果表明，在卒中后尽早使用黄连解毒汤具有预防卒中后认知障碍出现或进一步发展的作用，解毒治疗也有其“时间窗”。