清肝降浊颗粒对糖尿病脂肪肝大鼠脂代谢相关炎症因子与血管内皮功能的影响

丁云录，李驰坤，欧喜燕，李晓兵，成光宇，连树林

（长春中医药大学附属医院，长春 130021）

清肝降浊颗粒为国家名老中医刘铁军教授经验方研制而得现代中药制剂，对防治高脂血脂、脂肪肝及肝损伤有确切疗效，本实验研究清肝降浊颗粒对T2DM 合并NAFLD 大鼠模型脂代谢相关炎症因子、内皮功能等指标的影响，探讨其治疗非酒精性脂肪肝的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF 级SD 大鼠，8 周龄，雄性。饲养环境，室温（21±2）℃，相对湿度45%～65%，通风良好，室内12 h 明暗自动切换。动物购入后，分笼饲养，自由摄食、饮水。动物合格证号：SCXK-（吉）2018-0007，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。清肝降浊颗粒，以黄芪、五味子、刺五加、决明子、陈皮、竹茹等为处方，采用水煎煮的方法进行提取、浓缩制成颗粒，性状：深褐色颗粒，批号：20181015，由长春中医药大学实验研究中心提供。链脲佐菌素（STM），规格：每瓶500 mg，批号：WXBB6772V，美国Sigma 公司产品。血脂康胶囊，规格：0.3 g×12 粒/盒，批号：20180713，国药准字Z10950029，北京北大维信生物科技有限公司产品。胆酸钠（猪），规格：每瓶500 g，批号：K01N8B47111,上海源叶生物科技有限公司。胆固醇（饲料级），规格：每瓶500 g，批号：LOT5AF10250，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。总胆固醇（TC）检测试剂盒，规格：10 mL×10 支，批号：190421，中生北控生物科技股份有限公司产品。三酰甘油（TG） 检测试剂盒，规格：10 mL×10 支，批号：190517，中生北控生物科技股份有限公司产品。低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒，规格：10 mL×10 支，批号：190413，中生北控生物科技股份有限公司产品。游离脂肪酸（FFAs）测试盒，规格：100 T/盒，批号：20190528,南京建成生物工程研究所产品。超敏C-反应蛋白（hs-CRP）试剂盒，规格：96 T/盒，批号：20190301A，白细胞介素-6（IL-6）试剂盒，规格：96 T/盒，批号：20190301A，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒，规格：96 T/盒，批号：20190301A，血内皮素（ET-1）试剂盒，规格：96 T/盒，批号：20190301A，均购自美国RD 公司。酶标仪，型号：BIO680，Japan BIO RAD 公司；全自动分析仪，型号：selectra junior，荷兰威图公司；血糖仪，型号：HEA-232，达尔泰（天津）实业有限公司；高速冷冻离心机，型号：Biofuge Stratos，德国贺利氏公司；电热恒温水浴锅，型号：HH·SY21-Ni，北京长源试验设备厂。

1.2 方法[1-5]

1.2.1 动物造模与分组 SPF 级健康雄性8 周龄SD 大鼠，体质量（220±10）g，60 只，雄性，购入后，分笼饲养，使其适应环境1 周。随机分为：正常对照组，高脂模型组，阳性对照药血脂康胶囊400 mg/kg组，清肝降浊颗粒设800、400、200 mg/kg 3 个给药剂量组。共6组，每组10 只。参照文献，高脂饲料配制方法如下：胆固醇2.5%，胆酸钠0.5%，蔗糖5%，猪油10%，基础饲料82%。第1组动物饲以常规饲料，作为正常对照；2～6组动物均饲以高脂饲料。4 周后2～6组以30 mg/kg 剂量给予腹腔一次性注射STZ，用来破坏部分胰岛造模；正常对照组腹腔注射相应体积的生理盐水。建立糖尿病脂肪肝动物模型，检测血糖，当连续2 次以上出现FBG ≥7.8 mmol/L，并伴有胰岛素抵抗，视为成功建立了T2DM 模型。试验期间每周称量动物体质量1 次，以调整给药剂量。给药周期为8 周。

1.2.2 标本采集及指标检测 大鼠空腹血糖（FBG）水平、血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和游离脂肪酸（FFAs）、白细胞介素-6（IL-6）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血内皮素（ET-1）。

2 结果

2.1 对糖尿病脂肪肝大鼠血清炎症细胞因子TNF-α、IL-6 的影响 见表1。

2.2 对糖尿病脂肪肝大鼠血糖、血脂的影响 见表2。

2.3 对糖尿病脂肪肝大鼠血清FFA、hs-CRP 及ET-1的影响 见表3。

表1 清肝降浊颗粒对糖尿病脂肪肝大鼠血清TNF-α、IL-6 及血糖的影响（，n =10）

表1 清肝降浊颗粒对糖尿病脂肪肝大鼠血清TNF-α、IL-6 及血糖的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 清肝降浊颗粒对糖尿病脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C 的影响（，n =10）

表2 清肝降浊颗粒对糖尿病脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C 的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表3 清肝降浊颗粒对糖尿病脂肪肝大鼠血清FFA、hs-CRP 及ET-1 的影响（，n =10）

表3 清肝降浊颗粒对糖尿病脂肪肝大鼠血清FFA、hs-CRP 及ET-1 的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 讨论

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）人群中广泛流行，胰岛素抵抗架起了T2DM和非酒精性脂肪肝病间相互联系的病生理桥梁。2 型糖尿病伴有非酒精性脂肪肝病，促使患者病情加重和死亡风险增加，防治T2DM 患者非酒精性脂肪肝病为重中之重[6-8]。非酒精性脂肪肝病是2 型糖尿病较常见的并发症之一，近年 T2DM 与非酒精性脂肪肝病患病率急速上升，已严重影响人类的健康，二者间的密切关系的研究也得到更多的重视[9-10]。

研究[11-13]认为，机体多因素引起的IR 是脂质（游离脂肪酸和三酰甘油）在肝细胞过量蓄积的主要诱因，增加机体对内源性损伤因子的敏感性，使肝细胞发生脂肪变性，进而造成非酒精性脂肪肝病的“第一次打击”；“第二次打击”即被活化的内源性损伤因子通过氧化应激和脂质过氧化反应进一步加剧肝细胞损伤，进而使肝脏发生炎性反应、纤维化或坏死。FFA 使TG 合成增加，TG 在肝细胞内沉积,导致肝脏发生脂肪变性；同时还对肝细胞产生直接的毒性作用，引起肝细胞损伤。2 型糖尿病是一种遗传和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性复杂疾病，与胰岛素抵抗、肥胖、脂代谢紊乱、炎症等因素有关。而非酒精性脂肪肝病的发生和肥胖、脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗密切相关，肥胖、脂质代谢紊乱导致胰岛素过多，引起胰岛素抵抗。非酒精性脂肪肝病常伴随肠源性内毒素血症的发生，继而肠源性内毒素血症激活NF-κB 信号传导系统，刺激炎症指标CRP 的产生，同时引起胰岛素抵抗[14-15]。增加的TNF-α 可使NO 产生下降，而胰岛素抵抗可增强内皮细胞产生和释放ET-1，ET-1与NO 的比例失衡，最终引起血管内皮功能障碍而促使动脉粥样硬化发生[16-17]。

2 型糖尿病伴有非酒精性脂肪肝患者易致湿热阻滞中焦，水谷无法正常化为精微，反而生成痰浊膏脂，阻塞气机，影响气血运行，蕴而化热，导致气、血、痰、浊相结聚于肝胆，发而为病[18-20]。清肝降浊颗粒以中医理论为指导，以临床实践为基础，以现代科学研究为依据，以益气活血，化瘀通络为治则，用于脂肪肝（气虚血瘀）的治疗。主症：乏力，活动后尤甚，胁肋刺痛。次症：腹胀，食少纳呆，嗳气，舌质淡边有瘀点，苔薄白，脉细弦或细涩。处方合理，药味精练，药效学物质基础清楚，作用机理明确，治疗依据充分。在本实验中，应用T2DM 合并非酒精性脂肪肝病大鼠动物模型，给予大鼠清肝降浊颗粒800、400、200 mg/kg，3 个给药剂量混悬液灌胃8 周，血脂水平降低；异常升高的TNF-α、IL-6、FFAs、hs-CRP、ET-1 水平显著降低。表明清肝降浊颗粒可改善脂质代谢及脂代谢相关炎症因子及内皮功能，对肝细胞具有良好的保护作用，从而减缓大鼠2 型糖尿病非酒精性脂肪肝的病变。对清肝降浊颗粒的开发进一步提供实验室依据，有助于更新非酒精性脂肪肝的治疗理念，对非酒精性脂肪肝的防治有积极的影响。