辣椒脉斑驳病毒湖南分离物全基因组序列测定及分子特征

谭汝晴 罗香文 卜姗 张宇 张松柏 张德咏 刘勇

摘要：[目的]辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle VlFl3S，ChiVMV）是东南亚茄科作物主产地主要病毒种类之一，严重危害辣椒等茄科作物的生产。测定ChiVMV的全基因组序列，分析其分子特征，可以明确该病毒的适应性进化以及对我国辣椒等茄科作物的潜在威胁提供科学基础。[方法]以湖南疑似感染ChiVMV辣椒为样本，采用smallRNA高通量測序结合RT-PCR测定病毒全基因组序列，利用Mega、RDP及DnaSP等生物学软件分析其分子特征。[结果]ChiVMV湖南分离物全长基因组序列为9704nt（不包含3'-A尾），与其他分离物的序列同源性为84%～94%。系统发育分析表明，我国的ChiVMV聚类为一个亚簇，与其他国家和地区分离物不存在重组事件。基因的替换指数R=3.29，替换碱基类型主要是C/T替换。[结论]碱基替换突变可能是ChiVMV湖南分离物适应性进化的主要因素。

关键词：辣椒脉斑驳病毒;全基因组序列;系统发育分析;RNA突变和重组

中图分类号：S 436.418.1+2文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）02018705

0 引言

（研究意义）辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinalmottle virus，ChiVMV），属马铃薯Y病毒科（Potyvi-ridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），是茄科作物的主要病毒种类之一，严重危害茄科作物的生产。ChiVMV传播扩散过程中，在作物品种、环境等选择压力下，其基因组发生突变、重组等适应性进化，分析ChiVMV的全基因组序列，可以为分析ChiVMV的适应性进化分子机制提供科学依据。（前人研究进展）ChiVMV在马来西亚西部的辣椒上首次报道，现已扩展到东南亚多国，成为这些地区辣椒等茄科主要作物减产的主要原因之一。此外，在非洲的部分地区，也发现该病毒危害。目前，该病毒在我国多个地区有发生危害的报道。2003年，我国陕西辣椒上发现该病毒侵染;随后该病毒快速扩展至我国多个省份辣椒主产区，2016年湖南和福建两省的辣椒上ChiVMV检出率分别达到35%和20%。2017年报道的侵染贵州辣椒的ChiVMV株系，其亲缘关系与四川和云南株系亲缘关系最近。而广东辣椒ChiVMV株系与海南分离物的亲缘关系最近。这些研究表明，ChiVMV在我国呈现快速扩展的态势，且其基因组序列存在一定的遗传变异。（本研究切入点）虽然我国有少数几个ChiVMV分离物全基因组序列被测定，还有一些CP基因或基因片段被测定;但是ChiVMV分离物的分子特征、遗传进化等报道较少，ChiVMV在我国传播扩散、适应性进化的分子机制，目前尚不明确。（拟解决的关键问题）本研究在报道湖南和福建辣椒上ChiVMV发生的基础上，选择侵染湖南辣椒的ChiVMV分离物，测定其全基因组序列，分析其分子特征及其遗传进化，研究结果可为明确该病毒的适应性进化机制以及分析其对我国辣椒等茄科作物的潜在威胁提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣椒样本于2014年采自湖南省长沙市高桥镇，种植于湖南省植物保护研究所温室内。辣椒样本的症状为：叶片黄化、畸形，植株略矮缩。辣椒叶片样本经RT-PCR检测ChiVMV侵染。辣椒叶片样本采用液氮速冻，保存于-80℃。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA抽提、小RNA高通量测序及数据分析

总RNA抽提采用Trizol法（生工生物工程有限公司，上海），0.1g辣椒叶片，采用液氮研磨，加入Trizol试剂，离心取上清，加氯仿混匀，离心后加乙醇沉淀RNA，加入DEPC处理H20溶解总RNa.小RNA（sRNA）库采用Small RNA v1.5Sample Prep试剂盒（Illumina，USA）构建，具体步骤参考说明书，sRNA测序采用Solexa测序仪（Illumina，USA）。sRNA数据分析采用Illumina GA P1peline v1.3software，高质量的sRNA数据（18-30nt）采用软件Velvetl.0.5拼接成长片段。拼接后的长片段序列在GenBank的病毒数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome.cgi？）进行nblast比对。

1.2.2RT-PCR 根据sRNA高通量测序获得ChiVMV基因组序列片段，设计RT-PCR引物，引物序列见表1.RT-PCR参考文献。PCR产物纯化后连接到pEASY-T5载体（全式金，北京），序列委托生工生物技术有限公司测定。ChiVMV基因组全序列采用DNAMAN，version 8（Lynnon，Quebec，Canada）组装。

1.2.3序列遗传进化分析 ChiVMV CP基因或全基因组序列的系统发育分析，采用CLUSTAL w进行多序列联配，采用MEGA 5.0构建Maximum-likelihood系统发育树。序列重组分析采用RDP4软件，采用算法Recombination Detection Program（RDP），GENE-CONV，BOOTSCAN，MaxChi，CHIMAERA和SISCAN分析序列的重組事件。序列突变分析采用软件DnaSP（version 5）。

2结果与分析

2.1 ChiVMV湖南分离物全基因组序列特征

sRNA高通量测序结果表明，sRNA高通量测序共计获得10.25Mb序列（18-29nt），经过序列拼接，获得2563个长片段（contigs）（45-852nt）。nblast比对结果表明，37个contigs比对到ChiVMV基因组（NC 005778.1），覆盖约80%的ChiVMV全基因组。剩余20%序列由常规RT-PCR补齐。ChiVMV湖南分离物的全基因组序列为9704nt（不包含3'A尾）。该基因组序列在ENA（European NucleotideArchive）browser（http：//www.ebi.ac.uk/ena/data/view/LN832362）登录号为LN832362.

2.2ChiVMV序列系统发育分析

ChiVMV湖南分离物的全基因组序列系统发育分析表明，湖南分离物与韩国的2个分离物聚为1个亚簇，亲缘关系最近（图1）。GenBank中收录的ChiVMV的CP基因比其全基因组序列更多，因此，基于CP基因序列水平，分析了ChiVMV分离物的系统发育，结果（图2）表明，ChiVMV湖南分离物与印度分离物聚为1个亚簇。

2.3ChiVMV序列重组分析

ChiVMV全基因组序列重组分析（图3）表明，我国的ChiVMV分离物Yp8和印度分离物Ch-War有2个重组事件，Yp8分离物与印度分离物J0和Ch-jal各有1个重组事件;而ChiVMV湖南分离物与其他分离物没有重组事件。

2.4ChiVMV序列突变分析

采用DnaSP软件分析了ChiVMV分离物全基因组水平的基因突变，结果表明（表2），ChiVMV分离物之间的总体碱基替换突变偏差为R=3.29，且主要是C/T替换为主。在ChiVMV基因组序列中，总共有1249个核苷酸多态性位点，约占ChiVMV基因组序列的12.9%。

3 讨论与结论

植物病毒在与寄主/传毒介体以及环境的互作中，在选择压力下，其基因组序列会发生变异，从而产生适应性进化，快速扩展危害。ChiVMV全基因组序列分析结果表明，我国不同地区的分离物存在一定的分子变异，如贵州分离物与四川和云南分离物同源性高;而广东分离物与海南分离物亲缘关系近。本研究测定的ChiVMV湖南分离物，与其他分离物的同源性为84%～94%，与韩国分离物和印度的亲缘关系最近，表明ChiVMV在我国的不同地区存在不同的遗传变异。马铃薯Y病毒属可以摩擦接种，部分病毒通过传毒介体传播，此外，还有部分病毒可以种传，ChiVMV也可以种传，ChiVMV湖南分离物与韩国、印度分离物亲缘关系近，可能是由于湖南种植的品种，其亲本来源于韩国或印度的辣椒资源，通过种子方式引进。因此，急需开展更多ChiVMV分离物基因组序列测定，明确ChiVMV在我国的遗传变异情况，为分析该病毒的潜在威胁提供依据，也为抗性育种提供理论参考。

序列重组和突变，是植物病毒适应性遗传变异的2种最重要的方式;ChiVMV等正链RNA植物病毒，为适应不同品种、环境的选择压力，可通过重组和突变，显著改变其基因组序列，从而改变其病毒群体。ChiVMV分离物的重组和突变分析，目前报道较少。本试验研究表明，我国ChiVMV其他地区的分离物与韩国和印度分离物之间存在重组事件，表明重组在ChiVMV分离物遗传变异中发挥重要作用;然而，ChiVMV湖南分离物的遗传变异，可能与我国其他地区分离物不同，该分离物与其他ChiVMV分离物之间没有重组;进一步的分析表明，突變可能是ChiVMV湖南分离物遗传变异的主要原因。与植物DNA病毒相比，植物RNA病毒的基因组更易发生突变，从而适应寄主等选择压力。本研究结果表明，序列重组和突变在我国ChiVMV不同地区分离物的遗传变异中发挥不同的作用。

辣椒种植效益高，目前在我国广泛种植。鉴于ChiVMV在我国快速扩展，且其基因组遗传变异快，认为急需加强ChiVMV的监测，测定更多地区ChiVMV分离物的基因组序列，分析其遗传变异，为分析该病毒对辣椒等茄科作物的潜在威胁提供科学依据，也为抗性育种提供理论参考。