超声辅助酶法提取香菇柄滋味物质工艺优化

张爱爱,黄 文,王 益,刘 莹

(华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070)

香菇为担子菌纲、伞菌目、口蘑科、香菇属的一种传统的药食两用真菌,享有“蘑菇之王”的美誉,是继双孢蘑菇之后世界第二大栽培食用菌[1]。香菇中富含多种活性物质,其中香菇多糖具有降血压、抗癌、免疫调节等活性,基于此香菇已逐渐发展成为一种功能性食品[2-3]。但由于其纤维化程度高,咀嚼性和加工利用性较差,使其在采收及加工过程中被大量丢弃,造成资源的浪费[4]。

香菇独特的风味主要来源于非挥发性滋味物,研究表明香菇柄中含有丰富的可溶性糖、游离氨基酸、核苷酸等滋味物质[5-6]。香菇柄中滋味物质的提取方法主要有:热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法、固态发酵法等[7-9]。由于香菇柄中的大部分滋味成分被纤维素包裹而难以释放出来,目前香菇柄滋味物质提取率较低,限制了香菇柄滋味物质的利用。超声波辅助提取技术可以加速胞内物质溶出,缩短提取时间[10]。酶具备的高效性和专一性,有助于靶向破坏原料的细胞壁和细胞间质结构,加速胞内活性成分的溶出,提高提取率[11-12]。目前未见关于超声波辅助酶法提取香菇柄中滋味物质提取工艺方面的报道。

针对香菇柄中滋味物质提取率低的问题,本研究拟采用超声辅助酶法对香菇柄中可溶性糖、滋味肽、游离氨基酸等滋味物质进行提取,在单因素实验的基础上,通过响应面法优化提取工艺，以期提高香菇柄中滋味物质的提取率,为后续香菇柄资源的开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干制香菇柄 产自湖北襄阳;纤维素酶(50 U/mg) 上海源叶生物科技有限公司;一水合柠檬酸、二水合柠檬酸三钠、浓硫酸、茚三酮 均为国产分析纯。

DF-101S智能集热式恒温磁力搅拌器 武汉亨泰达仪器设备有限公司;US3120DH数控超声波清洗器 北京优晟联合科技有限公司;UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;ZNHW-II智能恒温电热套(1000 mL) 河南爱博特科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香菇柄的预处理 香菇柄粉碎后过60目筛,得筛下物为香菇柄粉,置于干燥器内密封保存。

1.2.2 香菇柄滋味物质的提取工艺 称取20 g香菇柄粉样品于1 L烧杯内,按一定料液比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=4.8),搅拌均匀,以一定的超声功率和超声时间对上述液体进行处理后,加入适量的纤维素酶,于50 ℃恒温水浴锅中搅拌酶解一定时间,沸水浴中灭酶10 min,蒸馏至馏出液为50 mL时停止蒸馏,剩余液体抽滤后定容至1000 mL,得香菇柄滋味物质提取液。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 超声功率的确定 按照“1.2.2”的方法,设定提取条件为:料液比1∶20 g/mL,超声时间10 min,纤维素酶添加量0.6%,酶解时间1.0 h,考察超声功率(60、120、240、360、480 W)对滋味肽、可溶性糖、游离氨基酸含量和滋味综合评分的影响。

1.2.3.2 超声时间的确定 在上述最优超声功率的基础上,设定提取条件为:料液比为1∶20 g/mL,加酶量为0.6%,酶解时间为1.0 h,考察超声时间(5、10、15、20、25 min)对滋味肽、可溶性糖、游离氨基酸含量和滋味综合评分的影响。

1.2.3.3 加酶量的确定 在上述最优超声功率和超声时间的基础上,设定提取条件为:料液比为1∶20 g/mL,酶解时间为1.0 h,考察加酶量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)对滋味肽、可溶性糖、游离氨基酸含量和滋味综合评分的影响。

1.2.3.4 酶解时间的确定 在上述最优超声功率、超声时间和加酶量的基础上,设定提取料液比为1∶20 g/mL,考察酶解时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)对滋味肽、可溶性糖及游离氨基酸含量和滋味综合评分的影响。

1.2.3.5 料液比的确定 在上述最优超声功率、超声时间、加酶量和酶解时间的基础上,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对滋味肽、可溶性糖及游离氨基酸含量和滋味综合评分的影响。

1.2.4 响应面优化实验 在单因素实验的基础上,选择对滋味物质综合评分影响较大的三个因素,即超声时间、加酶量和料液比三个因素为自变量,以滋味物质综合评分为响应值,通过Design Expert 8.0.6软件,采用Box-Behnken设计方法,进行三因素三水平的响应面分析实验,获得最佳提取工艺。实验因素水平设计见表1。

表1 响应面实验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 滋味物质含量的计算

1.2.5.1 滋味肽含量的测定 以牛血清蛋白为标准品,参照文献[13],进行测定,得滋味肽标准曲线线性回归方程为y=0.4128x+0.0046,R2=0.9999。取10 mL提取液,用活性炭脱色后定容至100 mL,取1.5 mL进行测定。

式中:C为根据吸光值计算出的溶液中对应物质的含量,mg;V为样液体积,mL;N为样液稀释倍数;W表示香菇柄干重的取样质量,g。

1.2.5.2 可溶性糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法[14]测定,以蔗糖为标准品,得可溶性糖标准曲线线性回归方程为y=0.0047x+0.0593,R2=0.9971。样品制备同1.2.5.1,取2 mL进行测定。

式中:C为根据吸光值计算出的溶液中对应物质的含量,mg;V为样液体积,mL;N为样液稀释倍数;W表示香菇柄干重的取样质量,g。

1.2.5.3 游离氨基酸含量的测定 采用茚三酮试剂显色法[14]测定,以亮氨酸为标准品,得游离氨基酸标准曲线线性回归方程为y=0.0036x-0.0766,R2=0.9983。样品制备同1.2.5.1,取2 mL进行测定,样液中游离氨基酸含量计算公式同1.2.5.2。

1.2.6 滋味综合评分计算 采用熵权法对滋味肽、可溶性糖及游离氨基酸含量进行滋味综合评价[15-17]。

滋味综合评分=(滋味肽含量/滋味肽含量max)×W1+(可溶性糖含量/可溶性糖含量max)×W2+(游离氨基酸含量/游离氨基酸含量max)×W3

式中:Wi为某一指标的权重值;Hi为第i个指标的信息熵;η为指标个数;(Xij)mn和(Pij)mn分别为m个评价对象和n个评价指标构成的原始指标数据矩阵和概率矩阵。

1.3 数据处理

为了保证实验的精确度,每个处理均重复三次,结果取平均值。采用Excel软件处理数据,Origin 9.0作图,响应面工艺优化实验通过Design Expert 8.0.6进行设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.2.1 超声功率对滋味物质的影响 由图1可知,随着超声功率的加强,可溶性糖、游离氨基酸及滋味肽含量和滋味综合评分整体呈现先升高后降低的趋势。可溶性糖、滋味肽含量及滋味综合评分均在120 W时达到最大值。游离氨基酸含量在60～240 W时持续增长,之后随着超声功率的升高而逐步降低,120～240 W时增长缓慢，这说明在超声功率小于120 W时,超声功率的增强,使可溶性糖、游离氨基酸、滋味肽等滋味物质迅速从细胞内游离出并溶解于提取液中,随着空化作用、均匀化作用的加强,提取液中滋味物质的含量达到最大值[18-20]。但当超声功率过大时,会引起局部的高温、高压,造成滋味物质的破坏,降低提取液中滋味物质的含量[21]。因此,选择120 W为最佳超声波处理功率。

图1 超声功率对香菇柄滋味物质的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.2 超声时间对滋味物质的影响 由图2可知,随着超声时间的延长,可溶性糖、游离氨基酸及滋味肽含量和滋味综合评分均呈现先升高后降低的趋势,且均在20 min时达到最大值。可能是超声时间达到一定值时,原料与溶质已充分接触,内容物不会再溶出,继续延长超声时间会伴随大量的热量产生,使可溶性糖发生焦糖化反应[22]、小分子肽发生变性,而游离氨基酸被空化作用产生的自由基氧化,造成含量下降[23]。因此,选择20 min为超声波处理最佳时间。

图2 超声时间对香菇柄滋味物质的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.3 加酶量对滋味物质的影响 由图3可知,加酶量对可溶性糖、游离氨基酸、滋味肽的含量和滋味综合评分的影响不同,可溶性糖含量和滋味物质综合评分在加酶量0.8%时达到最大值,滋味肽含量在加酶量0.4%时达到最大值,而游离氨基酸含量在加酶量为0.6%时达到最大值。总体来说,在加酶量达到0.4%时,滋味物质溶出量和滋味综合评分均达到较高水平。这是因为纤维素酶添加量低于0.4%时,酶与香菇柄中目标物质充分反应;当加酶量高于0.4%后,酶浓度过高,产物浓度增大,当反应达到平衡后,抑制了酶的作用,降低了滋味物质的含量[24]。随着纤维素酶添加量的增加,生产成本增大,选择纤维素酶的最适添加量为0.4%。

图3 加酶量对香菇柄滋味物质的影响Fig.3 Effect of the amount of enzyme on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.4 酶解时间对滋味物质的影响 由图4可知,可溶性糖含量及游离氨基酸含量和滋味综合评分随酶解时间的延长呈先升高后降低的趋势,且均在1.0 h时达到最大值。滋味肽在酶解2.0 h后,随着时间的持续延长,含量的增长趋于平缓。这是由于纤维素酶与底物充分反应一段时间后,体系中无多余底物继续与其发生反应,故即使时间继续延长,滋味肽含量也基本保持不变。而对于可溶性糖及游离氨基酸而言,酶解时间达到1.0 h后,随酶解时间的延长目标物质可能发生降解或者游离氨基酸与碳水化合物发生结合,进而导致含量下降[25]。因此,选择1.0 h为最佳纤维素酶处理时间。

图4 酶解时间对香菇柄滋味物质的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.2.5 料液比对滋味物质的影响 由图5可知,可溶性糖及滋味肽含量和滋味综合评分呈现不断上升趋势,在料液比达到1∶25 g/mL后,继续增大料液比,各物质含量增长均变迟缓。这是因为随着料液比的增大,香菇柄粉末中可溶性糖及滋味肽逐渐完全溶出,继续增大料液比,不能提高滋味物质的溶出量。游离氨基酸含量随料液比的增大呈现先升高后降低的趋势,在料液比为1∶15 g/mL时达到最大值。随着料液比的增大,游离氨基酸溶出量趋于饱和,继续增大料液比可能使其他水溶性物质溶出,导致游离氨基酸提取受阻。因此,选择1∶25 g/mL为料液比最佳水平。

图5 料液比对香菇柄滋味物质的影响Fig.5 Effect of material/liquid ratio on tasty components in the stipes of Lentinula edodes

2.3 响应面实验结果

由上述单因素实验结果可知,超声时间、加酶量和料液比三个因素引起滋味综合评分的波动值较大,即这三个因素对滋味物质综合评分的影响较大,故以滋味物质综合评分为响应值,选取超声时间(A)、加酶量(B)和料液比(C)为考查因素,进行响应面试验设计,实验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.1 模型建立和显著性分析 利用Design Expert 8.0对表2数据进行多元回归拟合分析,得方程为Y=0.92+0.019A+2.615E-004B+0.025C+0.011AB-0.038AC+0.046BC-6.863E-003A2-0.064B2+0.021C2,回归模型的方差分析见表3。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

P

P

R

2

R

2

[26]

2.3.2 响应面结果分析 由图6可直观看出各因素交互作用对滋味综合评分的影响,响应面坡度越陡峭表明香菇柄滋味综合评分受该因素的交互作用的影响越大,反之则受该因素的交互作用的影响越小[27]。由图6可知,加酶量和料液比及料液比和超声时间的响应面坡度均比较陡峭,而加酶量和超声时间的响应面坡度比较平缓,该结果与表3结果相符合。

图6 交互项对滋味综合评分影响的响应面Fig.6 Response surface showing the effect ofinteraction terms on taste comprehensive score

2.3.3 最佳工艺验证 通过Design Expert 8.0.6软件分析,得可溶性糖、游离氨基酸及滋味肽的最优提取工艺为:超声时间15 min、加酶量0.46%、料液比为1∶30 g/mL,此时模型预测的滋味综合评分为0.9795,在最佳工艺条件下进行三次重复试验,得滋味综合评分为0.9916±0.0022,与模型预测值之间的误差为1.24%,表明该模型预测性良好,实验结果可靠。其中在此条件下可溶性糖、滋味肽和游离氨基酸的含量分别达到73.38、595.42和26.23 mg/g。

3 结论

本研究采用超声辅助酶法提取香菇柄中的可溶性糖、滋味肽、游离氨基酸等滋味物质,在单因素实验的基础上,对滋味物质的提取工艺进行Box-Behnken响应面优化,得最佳提取工艺参数为:超声功率120 W,超声时间15 min,酶解时间1.0 h,纤维素酶添加量0.46%,料液比1∶30 g/mL。此条件下可溶性糖、滋味肽和游离氨基酸的含量分别为73.38、595.42和26.23 mg/g,三者的综合评分为0.9916,与模型预测值之间的误差为1.24%,表明该模型可用于预测香菇柄中滋味物质的提取工艺。该方法有利于可溶性糖、滋味肽、游离氨基酸等滋味物质从高度纤维化的香菇柄细胞中充分溶出,从而提高了香菇滋味物质的提取率,缩短了提取时间。该方法可以快速、高效地提取出香菇中滋味物质。研究结果为香菇柄中滋味物质的高值化制备提供了数据支撑,为后续香菇柄滋味物质的开发利用奠定基础。