响应面法优化碱蓬根总生物碱的提取工艺及其抑菌活性

吕梦迪,郭 斌,*,韩冠英,崔 錾

(1.锦州医科大学药学院,辽宁锦州 121000;2.锦州医科大学附属第一医院,辽宁锦州 121000)

藜科碱蓬属植物碱蓬(Suaedasalsa)又名翅碱蓬、黄须菜,为一年生草本植物,碱蓬在我国分布广泛,其根茎叶及种籽富含矿物质、脂肪、蛋白质和维生素等,是一种优质蔬菜、经济作物和具有医疗保健价值的植物资源[1]。碱蓬的药用价值早在《本草纲目拾遗》中就有记载,“盐蓬,味咸性寒,清热消积”[2],具有抗氧化[3]、抗炎[4]、降糖[5]、抗肿瘤[6]、抗衰老等作用而被广泛应用于医药行业。公衍玲等[7]研究了盐地碱蓬中成分的抗氧化、降糖及降脂活性;郝海燕等[8]对硬枝碱蓬的成分定性并测定生物碱含量。

目前生物碱的提取方法有很多,溶剂提取法因成本低、操作简单而较为常用[9]。梁艳妮等[10]采用响应面法优选马齿苋中总生物碱的溶剂提取条件,陈效威等[11]对止泻木种子中总生物碱的提取工艺进行优化。国内外对碱蓬已有诸多报道,付建鑫等[12]、李煦等[3]阐明了碱蓬中含有的蛋白质、黄酮、植物盐及多糖等成分,并研究了其具有的抑菌抗炎、调控血脂、调节糖代谢等功效,但有关碱蓬根生物碱的文献还较少。

本文以乙醇为溶剂提取碱蓬根总生物碱,通过单因素实验和响应面法优选最佳提取工艺,并对碱蓬根总生物碱的抑菌作用进行初步研究,以便更好地开发利用碱蓬资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碱蓬 2019年5月中旬采自辽宁锦州市周边沿海地区,经锦州医科大学郭斌教授鉴定为藜科碱蓬属碱蓬,洗净后取其根,阴凉处自然风干,粉碎,碱蓬根粉末保存备用;95%乙醇、石油醚(沸点30～80 ℃)、二氯甲烷 天津永晟精细化工有限公司;氢氧化钠(NaOH)等其他试剂 均为国产分析纯;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli) 均为本校微生物实验室提供。

FW-100高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;BP211D型电子分析天平 德国Sartorious公司;RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;恒温油水浴锅 上海腾方仪器设备有限公司;生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司;LDZM立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械;SPX-150B生化培养箱 上海博泰实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱蓬根总生物碱的提取 准确称取碱蓬根粉末10.0 g,按一定料液比加入一定浓度的乙醇,在一定温度下提取一定时间,且提取2次,合并提取液,旋转蒸发浓缩成浸膏,浸膏中加入5%盐酸溶液,调节pH3～4,过滤,滤液与石油醚以料液比1∶2除脂[13],取水相并用5% NaOH调节pH11～12,转入分液漏斗,等体积二氯甲烷萃取3次,每次30 min,合并萃取液,减压回收二氯甲烷,得总生物碱提取物,烘干后称量。

1.2.2 单因素实验 称取碱蓬根粉末10.0 g,以碱蓬根总生物碱得率为指标,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、乙醇浓度(55%、65%、75%、85%、95%)、提取温度(50、60、70、80、90 ℃)和提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)四个因素对碱蓬根总生物碱得率的影响,其中固定因素为:料液比1∶25 g/mL、乙醇浓度95%、提取温度70 ℃、提取时间2.0 h,每组设三次重复实验,取平均值。

1.2.3 响应面实验设计 根据Box-Benhnken设计原理,在单因素实验基础上,选择对碱蓬根总生物碱得率有显著影响的因素料液比(A),乙醇浓度(B),提取温度(C)和提取时间(D),进行四因素三水平的响应面实验,优化总生物碱的提取工艺。各因素水平如表1。

表1 响应面设计因素及水平表Table 1 Factors and levels ofthe response surface design

1.2.4 碱蓬根总生物碱得率的测定 参照文献[14]。

总生物碱得率(%)=提取的碱蓬根总生物碱质量/碱蓬根粉末质量×100

1.2.5 抑菌活性实验

1.2.5.1 培养基的配制 LB固体培养基:酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 g,琼脂粉20.0 g,NaCl 5.0 g,加水至1000 mL,121 ℃灭菌20 min;LB液体培养基:酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 10.0 g,加水至1000 mL,121 ℃灭菌20 min。

1.2.5.2 菌悬液的制备 将各供试菌种接种于无菌平板上,37 ℃、24 h培养后,获得活化的新菌种。接种环挑取少许典型菌落接种于液体培养基中,经37 ℃、24 h培养后,无菌生理盐水稀释成含菌1×106～1×107CFU/mL的菌悬液备用[15]。

1.2.5.3 抑菌效果的检测 采用管碟法[16],无菌条件下向已灭菌的培养皿中加入20 mL培养基,凝固后,移液枪移取各供试菌悬液100 μL滴加到培养基上,均匀涂布。将预先灭菌的牛津杯放于含菌培养皿中,分别加入240 μL的药液(浓度为0.2、0.4、0.8 mg/mL),以无菌水为对照,37 ℃下培养24 h。进行三次重复实验并记录抑菌圈直径。

1.2.5.4 最低抑菌浓度(MIC) 采用两倍稀释法[17],将碱蓬根生物碱分别稀释为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL,移取生物碱稀释液约1 mL于已灭菌试管并加入1 mL液体培养基和100 μL菌悬液,对照组只加入1 mL液体培养基1 mL无菌水和100 μL菌悬液,37 ℃下培养24 h。观察试管的混浊程度,以试管澄清完全没有菌落生长的最低生物碱稀释浓度为菌的最低抑菌浓度(MIC)[18]。

1.3 数据处理

实验数据以Origin 8.5软件作图,采用Design Expert 8.0.6软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对总生物碱得率的影响 由图1知,碱蓬根总生物碱得率随着料液比的不断增大呈先大幅度增加后逐渐减少的趋势。当料液比为1∶25 g/mL时,总生物碱得率达到最大值;料液比继续增大,总生物碱得率降低。可能是因为一定范围内料液比的增大利于提取溶剂与浸提物的接触,能提高得率,用量过多反不利于总生物碱的溶出,降低得率[19]。料液比1∶25 g/mL较为合适。

图1 料液比对总生物碱得率的影响Fig.1 Effect of material liquid ratioon extraction yield of total alkaloids

2.1.2 乙醇浓度对总生物碱得率的影响 由图2可得出,随乙醇浓度的提高,总生物碱得率也在不断增加,乙醇浓度为85%时,总生物碱得率最高;乙醇浓度大于85%后总生物碱得率下降。是由于乙醇浓度的提高,脂溶性成分溶出,这些成分可能同乙醇-水分子结合,从而与碱蓬根生物碱形成竞争关系,导致总生物碱的得率降低[20]。因此选择乙醇浓度为85%。

图2 乙醇浓度对总生物碱得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentrationon extraction yield of total alkaloids

2.1.3 提取温度对总生物碱得率的影响 由图3可看出,在一定温度范围内,总生物碱得率会随温度的上升而增高,温度的提升有利于加快活性成分的溶解及溶剂的渗透,所以提取效果较好;当温度超过80 ℃时得率反而下降,可能是温度过高使生物碱结构发生变化[21]。故提取温度为80 ℃。

图3 提取温度对总生物碱得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperatureon extraction yield of total alkaloids

2.1.4 提取时间对总生物碱得率的影响 由图4可知,在0.5～2.0 h范围内,碱蓬根总生物碱得率随时间的延长而不断提升,可能是由于提取时间的延长使原料药与溶剂完全混合[22];2.0 h后随着提取时间延长,提取率没有太大的变化。从资源节约上考虑,提取时间选择2.0 h。

图4 提取时间对总生物碱得率的影响Fig.4 Effect of extraction timeon extraction yield of total alkaloids

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据单因素实验,通过Design Expert 8.0.6软件建立四因素三水平的中心组合实验,形成以料液比(A)、乙醇浓度(B)、提取温度(C)及提取时间(D)为自变量,以碱蓬根总生物碱得率为响应值的29个实验方案,进行响应面分析,实验结果见表2。回归分析见表3。

表3 回归方程模型及方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 回归模型的建立及方差分析 采用Design Expert 8.0.6软件对表2实验结果进行回归分析。

表2 响应面实验设计方案及结果Table 2 RSM design scheme and results

可得回归方程:Y=0.52-0.00625A+0.004417B-0.016C+0.010D+0.015AB-0.004AC+0.0045AD-0.012BC-0.00253BD-0.013CD-0.027A2-0.052B2-0.050C2-0.034D2

2.2.3 响应面图分析 为了考察各因素对总生物碱得率的交互影响,利用Design Expert 8.0.6软件进行分析得到图5和图6。图5中,料液比和乙醇浓度的等高线呈椭圆形表明两者对总生物碱的交互作用显著,料液比和乙醇浓度的响应曲面坡度陡峭说明两者对总生物碱得率有明显的影响。由图6可知,总生物碱得率随提取温度和提取时间的增加先上升后下降,提取温度的陡峭程度大于提取时间,说明提取温度的影响大于提取时间;提取温度与提取时间交互作用的曲面陡峭,等高线椭圆形,表明它们的交互作用显著,对总生物碱得率的影响具有显著性。

图5 料液比和乙醇浓度的交互影响Fig.5 Interaction between the material liquid ratio and the ethanol concentration

图6 提取温度和提取时间的交互影响Fig.6 Interaction between the extraction temperature and the extraction time

2.2.4 验证试验 根据Design Expert 8.0.6软件分析,得出最佳提取条件:料液比1∶24.626 g/mL,乙醇浓度85.478%,提取温度78.195 ℃,提取时间2.088 h,此条件下总生物碱得率为0.520%。结合实际情况,调整提取条件为:料液比1∶25 g/mL,乙醇浓度86%,提取温度78 ℃,提取时间2.1 h。为进一步确定响应面法得到的工艺条件是否可行,现称取碱蓬根粉末3份,每份10.0 g,按上述最佳提取工艺条件进行三次重复试验,总生物碱得率平均值为0.521%±0.04%,该优化工艺具有可行性。

2.3 抑菌活性实验结果

2.3.1 碱蓬根总生物碱抑菌效果 由表4可以看出,碱蓬根总生物碱对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有抑菌效果,且对金黄色葡萄球菌的抑菌活性强于大肠杆菌,对枯草芽孢杆菌无抑菌效果。碱蓬根总生物碱浓度的不同对致病菌的抑菌性也不同,浓度升高,抑菌性增强。由此表明,碱蓬根总生物碱具有抑菌活性。

表4 碱蓬根总生物碱不同浓度的抑菌性Table 4 Antibacterial activity of total alkaloids from different concentrations of the roots of Suaeda salsa

2.3.2 碱蓬根总生物碱最低抑菌浓度(MIC) 由表5知,碱蓬根总生物碱对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)均为0.4 mg/mL;碱蓬根总生物碱对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更强一些,对大肠杆菌的效果弱些。

表5 碱蓬根总生物碱的最低抑菌浓度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of total alkaloids from the roots of Suaeda salsa

3 结论

本实验通过有机溶剂提取法提取碱蓬根总生物碱,在单因素实验基础上采用响应面法优化提取工艺,确定最优工艺条件为料液比1∶25 g/mL,乙醇浓度86%,提取温度78 ℃,提取时间2.1 h,此条件下碱蓬根总生物碱得率为0.521%±0.04%;实验发现碱蓬根总生物碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌活性,其抑菌性由大到小为:金黄色葡萄球菌>大肠杆菌,对枯草芽孢杆菌无抑菌活性。从资源利用方面看,本实验为开发和利用碱蓬及碱蓬根的潜在价值提供一定的参考依据。