鳞柄小奥德蘑多糖对巨噬细胞免疫功能的调节作用

王 晶，史 琪，随晶晶，常世民,,3，杜 娟，闫训友,,3

1廊坊师范学院生命科学学院；2河北省食药用菌资源高值利用技术创新中心；3廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室，廊坊 065000

多糖(polysaccharide)，又称为多聚糖，是指由10个以上的单糖分子缩合的多聚物[1]。在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物中，并在真菌细胞壁中约占90%[1]。近年来研究发现，多糖具有多种重要的生物学功能，如免疫调节[2]、抗氧化[3,4]和抗肿瘤[5]等。

鳞柄小奥德蘑(Oudemansiellafurfuracea)归属蘑菇目膨瑚菌科狭义小奥德蘑属[6]，其口味鲜美，营养丰富，经济价值较高，主要种植于北京、河北、山东、江苏等华北地区。目前对该物种的研究主要集中在栽培和活性物质提取等方面[3,7]。

巨噬细胞是机体非特异性免疫的重要组成部分，可产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、NO等炎症有关的细胞因子(cytokine)或信号分子，在天然免疫和获得性免疫中执行重要功能[2,7]。本论文通过体内实验和体外实验研究了初步分离纯化的鳞柄小奥德蘑多糖对小鼠巨噬细胞吞噬能力和细胞因子分泌量等免疫功能的影响，为其进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳞柄小奥德蘑(Oudemansiellafurfuracea)购自河北廊坊，由河北省食药用菌资源高值利用技术创新中心完成菌种鉴定[3]。ICR小鼠为斯贝福(北京)生物技术有限公司产品(许可证号SCXK(京)2016-0002)，雄性，5～6周龄，体重25 g左右；F12K培养基为美国Sigma公司产品；特级胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)为天津灏洋生物制品科技有限公司产品；DAF-FM双乙酸盐(DAF-FM DA)一氧化氮(NO)荧光探针、总一氧化氮检测试剂盒和双辛丁酸法(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品；小鼠TNF-α、IL-1、IL-6和白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)检测试剂盒为青岛海德诚生物工程有限公司产品；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MD44透析袋(截留分子量3.5 kD)和24孔板用细胞爬片为北京索莱宝科技有限公司产品。实验所需其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水机为美国Millipore公司产品；ALPHA 1-2 冷冻干燥机为德国Martin Christ公司产品；CKX41SF倒置显微镜(装有数码显微照相装置DP71)和BX53荧光显微镜(装有数码显微照相装置DP73)为日本Olympus公司产品；MCO-20AIC二氧化碳培养箱为日本SANYO公司产品；iMark酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 方法

1.3.1 鳞柄小奥德蘑多糖的提取和纯化

参考Wang等[3]方法，将鳞柄小奥德蘑子实体置于50 ℃恒温干燥箱中烘干，粉碎机粉碎、铜网过滤、95%乙醇除脂、低温烘干后，采用热水浸提、离心、除蛋白、透析和真空冷冻干燥等方法，得到鳞柄小奥德蘑多糖(polysaccharide fromO.furfuracea，OFP)样品。将多糖样品用0.09 g/L氯化钠溶液(生理盐水)配成母液，孔径为0.22 μm的无菌针头滤器抽滤后冷藏备用。

多糖含量和蛋白质含量测定分别采用苯酚-硫酸法和BCA法(蛋白质浓度测定试剂盒)。

1.3.2 巨噬细胞的收集

灌洗腹腔法。参考Zhang等[8]方法并稍改进，将小鼠处死后，75%医用酒精中浸泡2 min，重复2次转入超净工作台，取F12K培养液5 mL注入小鼠腹腔，轻柔腹部，吸取腹腔液，离心，将沉淀用F12K培养液(含10% FBS)悬浮后按5×106个/mL的细胞密度，接种至培养板中，5% CO2培养箱中37 ℃培养[9]。

1.3.3 多糖处理

体内实验。将ICR小鼠适应性饲养3天后，随机分为空白对照组、多糖处理组和阳性对照组，各组设5个重复，自由摄食和饮水。阳性对照组腹腔注射20 mg/L的LPS溶液1mL，多糖处理组分别腹腔注射50、100和200 mg/L的鳞柄小奥德蘑多糖溶液1 mL，空白对照组腹腔注射1 mL无菌生理盐水，正常饲养24 h后，按“1.3.2”方法收集巨噬细胞，鸡血红细胞吞噬法测定巨噬细胞的吞噬能力，荧光探针法测定细胞中NO含量。

体外实验。按“1.3.2”方法收集和接种ICR小鼠巨噬细胞，待细胞贴壁后，吸弃上层培养基，添加不含血清的F12K培养液，并将细胞分为阳性对照组、多糖处理组和空白对照组。阳性对照组添加终浓度为20 mg/L的LPS，多糖处理组分别添加终浓度为50、100和200 mg/L的无菌鳞柄小奥德蘑多糖溶液，空白对照组添加等量的无菌生理盐水，继续培养24 h后，分别收集细胞和培养上清。鸡血红细胞吞噬法测定巨噬细胞的吞噬能力，荧光探针法测定细胞中NO含量，酶联免疫吸附实验测定细胞培养上清中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的浓度。

1.3.4 细胞吞噬能力测定

鸡血红细胞吞噬法。参考Wang等[8,10]方法稍改进，收集细胞至洁净载玻片上(体内实验)或吸弃细胞培养板中培养液(体外实验)，添加1%(体积比)鸡血红细胞悬液，经37 ℃孵育、磷酸缓冲溶液漂洗、4%多聚甲醛固定、吉姆萨染液(工作液)染色、流水冲洗后镜检。巨噬细胞的吞噬能力用吞噬百分率(%)来评价，以吞噬鸡血红细胞的巨噬细胞数量和巨噬细胞总数的比值表示[10]。

1.3.5 NO含量的检测

荧光探针法[7]检测巨噬细胞内NO含量。按“1.3.3”方法收集腹腔注射多糖处理24 h的巨噬细胞，离心后加入适量荧光探针。或按“1.3.2”方法收集小鼠巨噬细胞，接种至培养板(内置细胞爬片)中，添加不同浓度多糖处理后，取出细胞爬片，细胞面朝上置于湿盒中，加入适量荧光探针[7]。参照DAF-FM DA试剂盒说明，用稀释400倍的探针，孵育细胞30 min，洗涤2次后，荧光显微镜拍照，软件IPP(Image-Pro Plus)分析和测定平均光密度值(相对值)[7]。

用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐后，Griess法检测巨噬细胞培养上清中总一氧化氮浓度。按照试剂盒说明，用超纯水配制2 mmol/L NADPH，并将试剂盒中NaNO2标准品稀释成0、2、5、10、20和40 μmol/L。实验前将Griess reagent I和II，室温放置30 min，在96孔细胞培养板中依次加入标准品或巨噬细胞培养上清60 μL、2 mmol/L NADPH 5 μL、FAD 10 μL和Nitrate reductase 5 μL，混匀，37 ℃孵育30 min；依次加入LDH Buffer 10 μL、LDH 10 μL，混匀，37 ℃孵育30 min；加入Griess reagent I 50 μL和Griess reagent II 50 μL，混匀后室温孵育10 min。每组设3个重复。酶标仪测定A540 nm，根据NaNO2浓度标准曲线计算各实验组NO浓度。

1.3.6 TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12分泌量的测定

酶联免疫吸附实验(双抗体夹心法)[9]。参照试剂盒说明操作，并根据各标准品的浓度曲线计算培养上清中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12浓度。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 鳞柄小奥德蘑多糖含量

以葡萄糖为标准糖，采用苯酚-硫酸法测定鳞柄小奥德蘑多糖样品中糖含量，得到葡萄糖浓度x与吸光度值A的直线回归曲线为y=0.016 8x+0.031 6；决定系数[11]r2=0.998 0，表示糖浓度与吸光度值之间具有良好的线性正相关关系，经计算，鳞柄小奥德蘑多糖样品中糖含量为88.75%±1.24%，考虑到多糖提取工艺中的多次透析过程和透析袋的截留的分子量(3.5 kD)大小，认为鳞柄小奥德蘑多糖样品中多糖含量为：88.75%±1.24%。以牛血清白蛋白BSA为标准蛋白，采用BCA法测定鳞柄小奥德蘑多糖样品中蛋白质含量，得到蛋白质浓度x与吸光度值A的直线回归曲线为y=0.743 9x+0.007 9；决定系数r2=0.991 8，表示蛋白质浓度与吸光度值之间具有良好的相关关系，经计算，鳞柄小奥德蘑多糖样品中蛋白质含量为0.96%±0.05%。说明，提取的鳞柄小奥德蘑多糖中的蛋白质已被有效去除。

2.2 体外培养的小鼠巨噬细胞

采用F12K培养液灌洗腹腔、离心收集和无菌接种等方法，启动小鼠巨噬细胞的原代培养。结果显示，体外培养的小鼠巨噬细胞透光性较好，接种培养板24 h后，绝大多数细胞已贴壁或半贴壁，贴壁牢固，呈不规则形态(见图1)，这与Ni[12]和Yu[13]等分离和体外培养的巨噬细胞生长状态相似。巨噬细胞为终末分化细胞，体外无法增殖，为防止胎牛血清(FBS)中免疫相关蛋白或细胞因子对实验结果的影响，体外接种培养24 h后，将含10% FBS的F12K

图1 接种培养24 h后的小鼠巨噬细胞(标尺=100 μm)Fig.1 Murine peritoneal macrophages cultured in vitro for 24 h (scale=100 μm)

培养液更换为不含血清的F12K培养液。研究显示，短期无血清培养不会影响细胞的RNA的转录和蛋白质的合成[14]，但时间过长(超过24 h)会导致培养细胞的大量死亡[15]，故本实验将鳞柄小奥德蘑多糖处理的时间控制在24 h。

2.3 多糖对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞由血液循环中的单核细胞进入组织后分化而来，能够吞噬和清除凋亡细胞及非功能性的胞外成分[16]。本实验采用鸡血红细胞吞噬法检测了多糖处理前后小鼠巨噬细胞吞噬能力的变化。结果显示，与空白对照组相比，20 mg/L LPS处理组和200 mg/L鳞柄小奥德多糖处理组巨噬细胞的吞噬能力显著增强(见图2)。

2.4 多糖对小鼠巨噬细胞合成NO的影响

NO是在外界信号刺激下，由巨噬细胞、血管内皮细胞或神经细胞等多种细胞合成的、可跨质膜自由扩散的信号分子[17]。细胞内的NO可使用荧光探针DAF-FMDA检测，荧光的强弱间接反映细胞中NO的含量[7,9]；细胞培养上清中NO含量可使用总NO测定试剂盒(硝酸盐还原酶+Griess法)检测[7,9]。实验结果显示，与空白对照组(生理盐水组)相比，腹腔注射50～200 mg/L鳞柄小奥德蘑多糖处理24 h，小鼠巨噬细胞中荧光探针的平均光密度值均显著增强(P<0.05)，细胞培养上清中总NO浓度显著增加(P<0.05)(见表1)，具有浓度依赖性(见图3和图5)；体外培养体系中添加终浓度为50～200 mg/L鳞柄小奥德蘑多糖处理24 h，巨噬细胞中荧光探针的平均光密度值亦显著增强(P<0.05)，细胞培养上清中总NO浓度显著亦增加(P<0.05)(见表1)，具有浓度依赖性(见图4和图5)；相同浓度的多糖体内外处理24 h对小鼠巨噬细胞NO的合成无显著性差异。说明，鳞柄小奥德蘑多糖处理24 h可促进巨噬细胞细胞质中NO的合成量。

图2 鳞柄小奥德多糖对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响Fig.2 Effect of OFP on phagocytic activity of murine peritoneal macrophages.注：*与空白对照组相比，P<0.05。Note:*Compared with control group,P<0.05.

2.5 多糖对小鼠巨噬细胞TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12分泌量的影响

为进一步研究鳞柄小奥德蘑多糖对巨噬细胞免疫功能相关的细胞因子分泌量的影响，收集体外实验的巨噬细胞培养上清，并参照试剂盒说明进行酶联免疫吸附实验。结果显示，原代培养的小鼠巨噬细胞可分泌TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12(见表1)，其中TNF-α、IL-1和IL-6的浓度较高，分别为64.40±1.50、62.60±1.75和96.33±2.13 ng/L(见表1)，IL-12浓度较低，只有3.76±0.04 ng/L(见表1)。与空白对照组相比，鳞柄小奥德蘑多糖处理可不同程度的影响小鼠巨噬细胞对TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的分泌量。其中，终浓度为50～200 mg/L的鳞柄小奥德蘑多糖处理24 h可极显著提高巨噬细胞对IL-6和IL-12的分泌量(P<0.01)(见表1)，终浓度为100～200 mg/L的鳞柄小奥德蘑多糖可显著提高巨噬细胞对TNF-α、IL-1的分泌量(P<0.05)(见表1)。

图3 NO荧光探针标记的体内实验的小鼠巨噬细胞(标尺=100 μm)Fig.3 Murine peritoneal macrophage treated by OFP in vivo and stained by NO fluorescence probe (scale=100 μm)注：A：空白对照组；B：20 mg/L LPS处理组；C～E：50、100、200 mg/L鳞柄小奥德蘑多糖处理组；下同。Note:A:Control;B:Treated with 20 mg/L LPS;C～E:Treated with 50,100 and 200 mg/LOFP,respectively；The same below.

图4 NO荧光探针标记的体外培养的小鼠巨噬细胞(标尺=100 μm)Fig.4 Murine peritoneal macrophages cultured in vitro,treated by OFP and stained by NO fluorescence probe (scale=100 μm).

图5 各组小鼠巨噬细胞中NO荧光的平均光密度值Fig.5 The average optic density of NO fluorescence in murine peritoneal macrophages in different groups.注：*与空白对照组相比，P<0.05。Note:*Compared with control group,P<0.05.

3 讨论和结论

目前，对鳞柄小奥德蘑多糖的生物学活性的研究，集中在抗氧化活性和免疫调节方面。如Ma[18]通过灌胃小鼠，发现一定鳞柄小奥德蘑多糖可提高实验动物CD4+T淋巴细胞含量，促进脾淋巴细胞的增殖，提高血清中IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α含量。本实验室前期通过建立细胞共培养体系，研究了鳞柄小奥德蘑多糖对其中的大鼠肺巨噬细胞系和结直肠癌细胞的影响。发现鳞柄小奥德蘑多糖可提高肺巨噬细胞系对NO和TNF-α的分泌，从而抑制结直肠癌细胞的增殖[7]。以上研究过程和结果均未涉及鳞柄小奥德蘑多糖对体外培养的正常的巨噬细胞免疫功能的调节作用。

表1 鳞柄小奥德蘑多糖对小鼠巨噬细胞NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12分泌量的影响Table 1 Effects of OFP on the secretion of NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 of murine macrophages.

注：与空白对照组相比，*P<0.05;**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01.

研究发现，LPS或其他免疫调节剂的刺激，可引起巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞[19,20]，表达NO[21]、TNF-α、IL-1和IL-6等多种细胞因子或信号分子[22]，产生活性氮或活性氧[23,24]，调节机体的免疫功能[7]、抑制病原菌增殖[22]和诱导细胞凋亡[24]。

为了深入了解鳞柄小奥德蘑多糖对机体正常的巨噬细胞的影响作用，本论文采用灌洗腹腔的方法，获得了原代培养的小鼠巨噬细胞。利用巨噬细胞的体外培养体系并结合腹腔注射多糖实验，采用荧光探针标记、总一氧化氮测定和酶联免疫吸附实验等方法，较系统的研究了鳞柄小奥德蘑多糖对小鼠巨噬细胞吞噬能力、细胞中NO合成量、培养上清中NO和细胞因子分泌量的影响。结果显示，一定浓度的鳞柄小奥德蘑多糖处理可显著增强巨噬细胞吞噬能力，提高细胞对NO、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的合成和分泌。推测，鳞柄小奥德蘑多糖可刺激巨噬细胞极化为M1型，进而调节机体的免疫能力[9]。研究结果对相关功能性食品或保健品的开发提供理论基础。