刺五加有效成分及体外抑制二酰基甘油酰基转移酶活性研究

李 志，熊大玺，修孟雪，王 东，崔 龙*

1吉林市化工医院，吉林 132101；2北华大学药学院，吉林 132013

甘油三酯(TG)是真核生物能量储存的主要形式，当人体摄入的能量超过其消耗的能量时，过剩的能量便以TG的形式储存在脂肪组织，同时过多的TG也会在胰岛β细胞、肝脏等组织沉积，最终导致肥胖和糖尿病等其他疾病[1]。二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)作为催化TG合成的关键最后一步，是TG合成的限速酶[2]。DGAT有两种亚型DGAT1和DGAT2。经研究发现DGAT1/2抑制剂在预防肥胖、调节脂代谢紊乱、预防肝脂肪变性等方面有重要的药物研究价值[2]。

刺五加，又名五加参、刺拐棒，是五加科植物刺五加(AcanthopanaxsenticosusHarms)的根和根茎，主治脾肾阳虚，腰膝酸软，体恤乏力，失眠，多梦，食欲缺乏。目前对刺五加药效物质研究方面报道较多，但大多以皂苷、多糖和黄酮类较为集中。如皂苷类成分具有防治糖尿病[3]、抗肿瘤[4]、保护心脑血管[5]的作用；多糖类成分具有调节免疫功能的作用[6]；酚酸类成分具有抗疲劳作用[7]；黄酮类成分具有抗氧化活性和抗菌、抗炎[7]等作用。本研究主要报道从刺五加茎中筛选有效抑制DGAT活性化合物，并测试它们的有效抑制浓度。

1 仪器与材料

1H NMR和13C NMR用INO-VA-500 MHz型核磁共振仪(美国CIL公司，TMS为内标)；MS 用QSTAR质谱仪；ELISA酶标仪(美国)；DGAT酶(美国Biomol公司)；C18薄层色谱板F254(Merck公司)；反相柱色谱ODS(Nacalai Tesque公司)；高效液相色谱所用试剂为色谱纯，其余均为分析纯。

刺五加于2014年10月采于吉林省白山市长白山周边地区，经过延边大学药学院李镐教授鉴定为A.senticosus。标本收藏于北华大学药学院药物化学实验室(标本号为：AO20141018)。

2 实验方法

2.1 提取与分离

将干燥粉碎的刺五加茎5.0 kg，用75%乙醇室温每浸泡3天提取1次，共提取3次，合并乙醇提取液，减压浓缩得乙醇浸膏；将浸膏溶于水中成混悬液之后用二氯甲烷萃取，减压回收二氯甲烷溶剂，得二氯甲烷萃取物150.0 g。将二氯甲烷萃取物经硅胶柱色谱分离，利用正己烷∶乙酸乙酯=50∶0→0∶1(V/V)为流动相进行梯度洗脱，收集分离组分，并利用硅胶薄层色谱检测，成分相同的分离组分合并。得到A至G共7个分离组分。分离组分E，经反相高效液相色谱法，使用RP-18柱(10 × 250 mm，10 μm)，以乙腈∶水=70∶30→100∶0(V/V)作为流动相梯度洗脱得化合物1(8.4 mg)和4(7.8 mg)。分离组分G，200目硅胶柱色谱，利用正己烷∶乙酸乙酯=10∶1→0∶1(V/V)为流动相进行梯度洗脱，得到G1至G7个分离组分，G6经甲醇重结晶得到化合物8(10.1 mg)。组分G5 经过200～300目硅胶柱色谱，利用正己烷∶乙酸乙酯=8∶1→0∶1(V/V)为流动相进行梯度洗脱，得到G5-1至G5-7个分离组分。分离组分G5-2，经反相高效液相色谱法，利用80%乙腈为流动相洗脱得到化合物5(6.8 mg)和6(12.1 mg)；G5-3以乙腈∶水=80∶20→95∶5(V/V)作为流动相梯度洗脱得化合物2(4.9 mg)和10(5.4 mg)；G5-5以甲醇∶水=2∶1→95∶5(V/V)作为流动相梯度洗脱得化合物3(6.2 mg)，7(3.5 mg)和9(7.3 mg)；G5-6 以甲醇∶水=5∶95→20∶80(V/V)作为流动相梯度洗脱得化合物11(7.1 mg)和12(4.7 mg)。

2.2 抑制DGAT活性检测

活性测定方法：96孔板上加入样品、缓冲液[175 mM Tris-HCl(pH=7.5)，DGAT1/2，100 mM MgCl2(DGAT2；5 mM MgCl2)]，0.2 mMsn-1，2-二酰基甘油，0.25 mg无脂肪酸的牛血清白蛋白和10 μM [1-14C]甘油酰基-辅酶A(2.75 μCi)，短暂震荡，恒温25 ℃反应30 min，加入1.5 mL 2-丙醇∶庚烷∶水= 80∶20∶2(V/V/V)停止反应，用1.0 mL庚烷和0.5 mL水提取脂质涡旋后，将1.2 mL的有机相转移到玻璃管中，用2.0 mL碱性乙醇溶液[乙醇∶0.5 N NaOH∶H2O=50∶10∶40(V/V/V)]洗涤一次，最后用液体闪烁计数器测定其放射性[8]。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1黄色粉末状；ESI-MS：m/z401.1 [M + Na]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：1.83(2H，m，H-8′)，2.63(2H，m，H-7′)，3.44(1H，m，H-9a′)，3.54(2H，m，H-9)，3.73(1H，m，H-9b′)，3.83(3H，s，5-OCH3)，3.86(3H，s，2′-OCH3)，4.22(1H，m，H-8)，4.91(1H，m，H-7)，6.74(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.76(1H，d，J= 8.0 Hz，H-3)，6.87(1H，s，H-3′)，6.84(1H，d，J= 8.0 Hz，H-2)，6.95(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6′)，7.05(1H，s，H-6)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：133.8(C-1)，120.9(C-2)，116.0(C-3)，147.6(C-4)，148.9(C-5)，111.8(C-6)，74.2(C-7)，87.8(C-8)，62.3(C-9)，147.2(C-1′)，151.8(C-2′)，114.0(C-3′)，138.3(C-4′)，122.1(C-5′)，119.7(C-6′)，32.6(C-7′)，35.7(C-8′)，62.0(C-9′)，56.8(5-OCH3)，56.5(2′-OCH3)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故确定为赤式-愈创木基丙三醇-β-O-4′-二羟基松柏醇。

化合物2无色油状；ESI-MS：m/z237.1 [M + Na]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：1.47(6H，s，H-4′，H-5′)，5.65(1H，d，J= 9.6 Hz，H-2′)，6.32(1H，d，J= 9.6 Hz，H-1′)，6.55(1H，dd，J= 15.6，7.6 Hz，H-8)，6.83(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5)，7.22(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2)，7.33(1H，dd，J= 8.6，2.0 Hz，H-6)，7.35(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，9.64(1H，d，J= 7.6 Hz，CHO)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：127.2(C-1)，126.4(C-2)，121.6(C-3)，156.5(C-4)，117.4(C-5)，130.6(C-6)，153.2(C-7)，126.8(C- 8)，194.2(C-9)，121.3(C-1′)，131.5(C-2′)，77.2(C-3′)，28.3(C-4′)，28.1(C-5′)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故确定为(E)-3-(2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)prop-2-enal。

化合物3淡黄色油状；ESI-MS：m/z403.1 [M - H]-；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.35(br d，J= 11.2 Hz，Hb-9)，3.71～3.77(m，Ha-9)，3.83(s，MeO-3′，5′)，4.14(br s，H-8)，4.85(d，J= 5.0 Hz，H-7)，6.63(d，J= 7.5 Hz，H-5)，6.65(dd，J= 15.5，7.5 Hz，H-8′)，6.71(d，J= 7.5 Hz，H-6)，6.91(br s，H-2)，7.05(br s，H-2′，6′)，7.51(d，J= 15.5 Hz，H-7′)，9.52(d，J= 7.5 Hz，H-9′)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：133.6(C-1)，110.7(C-2)，147.8(C-3)，146.3(C-4)，115.1(C-5)，120.2(C-6)，73.2(C-7)，87.8(C-8)，61.2(C-9)，130.6(C-1′)，106.7(C-2′)，154.3(C-3′)，139.1(C-4′)，154.4(C-5′)，107.1(C-6′)，153.3(C7′)，129.1(C-8′)，193.7(C-9′)，55.6(3-OMe)，56.5(3′，5′-OMe)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故确定为7′E-4,9-dihydroxy-3,3′,5′-trimethoxy-8,4′-oxyneolign-7′-en-9′-al。

化合物4黄色粉末状；ESI-MS：m/z413.1 [M + Na]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：1.81(2H，m，H-8′)，2.62(2H，m，H-7′)，3.48(1H，m，H-8)，3.58(2H，m，H-9′)，3.75(1H，m，H-9a)，3.82(6H，s，3，5-OCH3)，3.85(1H，m，H-9b)，3.87(3H，s，3′-OCH3)，5.46(1H，d，J= 5.5 Hz，H-7)，6.66(2H，s，H-2，6)，6.75(2H，s，H-4′，6′)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：132.6(C-1)，102.7(C-2)，147.9(C-3)，135.6(C-4)，147.8(C-5)，102.7(C-6)，87.6(C-7)，54.1(C-8)，63.7(C-9)，128.4(C-1′)，146.0(C-2′)，143.8(C-3′)，112.7(C-4′)，135.5(C-5′)，116.6(C-6′)，31.8(C-7′)，34.3(C-8′)，60.8(C-9′)，55.3(3，5-OCH3)，55.2(3′-OCH3)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故确定为5-甲氧基去氧双松柏醇。

化合物5黄色粉末状；ESI-MS：m/z383.1 [M + Na]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δH：1.83(2H，m，H-8′)，2.65(2H，m，H-7′)，3.49(1H，m，H-8)，3.57(2H，m，H-9′)，3.72(1H，m，H-9a)，3.82(1H，m，H-9b)，3.83(3H，s，3-OCH3)，3.87(3H，s，3′-OCH3)，5.52(1H，d，J= 6.0 Hz，H-7)，6.76(2H，s，H-4′，6′)，6.78(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.81(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6)，6.95(1H，s，H-2)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δC：1134.9(C-1)，110.6(C-2)，49.2(C-3)，147.61(C-4，2′)，115.9(C-5)，119.8(C-6)，89.1(C-7)，55.6(C-8)，65.0(C-9)，129.7(C-1′)，147.6(C-2′)，145.5(C-3′)，114.1(C-4′)，137.3(C-5′)，118.1(C-6′)，33.0(C-7′)，35.9(C-8′)，62.5(C-9′)，56.8(3-OCH3)，56.4(3′-OCH3)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故确定为去氧双松柏醇。

化合物6白色粉末；EI-MS：m/z420.3 [M]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：2.45(1H，q，8-H)，2.56(1H，dd，J= 13.5，11.0 Hz，7′- Ha)，2.75(1H，m，8′-H)，2.95(1H，dd，J= 13.5，5.0 Hz，7′-Hb)，3.83(1H，dd，J= 8.5，5.0 Hz，9′-Ha)，3.73～3.81(1H，overlapped，9-Ha)，3.84(6H，s，3′，5′-OCH3)，3.84(6H，s，3，5-OCH3)，3.91(1H，dd，J= 13.0，7.0 Hz，9-Hb)，4.04(1H，dd，J= 8.5，7.0 Hz，9′-Hb)，4.76(1H，d，J= 7.0 Hz，7-H)，6.43(2H，s，2′，6′-H)，6.59(2H，s，2，6-H)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：131.7(C-1)，102.8(C-2)，147.3(C-3)，134.4(C-4)，147.3(C-5)，102.7(C-6)，83.2(C-7)，52.8(C8)，61.1(C-9)，133.2(C-1′)，105.3(C-2′)，147.3(C-3′)，134.2(C-4′)，147.3(C-5′)，105.4(C-6′)，33.8(C-7′)，42.5(C-8′)，72.6(C-9′)，56.4(2×OCH3)，56.5(2×OCH3)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故确定为5,5′-二甲氧基落叶松脂素。

化合物7白色粉末；EI-MS：m/z422.4 [M]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：1.83(2H，m，8，8′-H)，2.62(2H，dd，J= 13.5，6.0 Hz，7，7′-Ha)，2.73(2H，dd，J= 13.5，7.5 Hz，7，7′-Hb)，3.55(2H，dd，J= 12.0，5.0 Hz，9，9′- Ha)，3.81(3H，s，-OCH3)，3.83～3.86(2H，9，9′-Hb)，6.31(4H，s，Ar-H)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：131.3(C-1)，105.4(C-2)，146.6(C-3)，132.7(C-4)，146.8(C-5)，105.4(C-6)，43.6(C-7)，36.3(C-8)，61.2(C-9)，131.4(C-1′)，105.4(C-2′)，146.7(C-3′)，132.6(C-4′)，146.6(C-5′)，105.4(C-6′)，43.5(C-7′)，36.7(C-8′)，61.2(C-9′)，56.1(4×OCH3)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故确定为5,5′-二甲氧基开环异落叶松树脂酚。

化合物8白色粉末；ESI-MS：m/z453.1 [M + Na]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.53(1H，m，H-9′)，3.94(1H，m，H-9′)，3.95(9H，s，3′，4′，5′-OCH3)，3.97(3H，s，6-OCH3)，4.03(1H，dt，H-8′)，5.07(1H，d，J= 8.0 Hz，H-7′)，6.24(1H，d，J= 9.0 Hz，H-3)，6.56(1H，s，H-5)，6.69(2H，s，H-2′，H-6′)，7.95(1H，d，J= 9.0 Hz，H-4)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：161.1(C-2)，112.2(C-3)，138.1(C-4)，92.7(C-5)，152.2(C-6)，149.6(C-7)，132.2(C-8)，140.1(C-9)，103.4(C-10)，126.1(C-1′)，103.1(C-2′)，152.7(C-3′)，137.3(C-4′)，152.8(C-5′)，103.1(C-6′)，77.2(C-7′)，78.2(C-8′)，61.3(C-9′)，56.4(6-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，60.7(4′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故确定为(7′S,8′S)-4′-O-甲基黄花菜木脂素。

化合物9白色粉末状；EI0MS：m/z596.2 [M]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：2.47(1H，dd，J= 13.0，12.0 Hz，H-7a)，2.61(1H，m，H-8′)，2.70(1H，m，H-8)，2.83(1H，dd，J= 13.0，5.0 Hz，H-7b)，3.72(1H，dd，J= 8.5，6.0 Hz，H-9a)，3.84(12H，s，3，5，3′，5′-OCH3)，3.93(3H，s，3′′-OCH3)，4.04(1H，dd，J= 8.5，7.0 Hz，H-9b)，4.33(2H，dd，J= 12.5，7.0 Hz，H-9′)，4.75(1H，d，J= 6.5 Hz，H-7′)，5.73(1H，d，J= 13.5 Hz，H-8′′)，6.34(2H，s，H-2，H-6)，6.52(2H，s，H-2′，H-6′)，6.81(1H，d，J= 13.5 Hz，H-7′′)，6.86(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′′)，7.12(1H，dd，J= 8.5，2.0 Hz，H-6′′)，7.77(1H，d，J= 13.5 Hz，H-2′′)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：131.3(C-1)，105.4(C-2)，147.3(C-3)，133.4(C-4)，147.7(C-5)，105.3(C-6)，33.9(C-7)，42.8(C-8)，72.9(C-9)，133.8(C-1′)，102.7(C-2′)，147.3(C-3′)，134.4(C-4′)，147.3(C-5′)，102.7(C-6′)，83.6(C-7′)，49.4(C-8′)，62.7(C-9′)，127.5(C-1′′)，112.9(C-2′′)，145.6(C-3′′)，147.6(C-4′′)，114.2(C-5′′)，126.2(C-6′′)，144.7(C-7′′)，115.7(C-8′′)，166.4(C-9′′)，56.4(3-OCH3)，56.4(5-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)，55.8(3′′-OCH3)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故确定为(+)-9′-O-(Z)-阿魏酰-5,5′-二甲氧基落叶松脂素。

化合物11白色粉末；ESI-MS：m/z417.1 [M + H]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.12～3.70(6H，m，Glc-H-2″-6″)，5.12(1H，d，J= 7.5 Hz，Glc-H-1″)，6.81(2H，d，J= 8.0 Hz，H-3′，5′)，7.11(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6)，7.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，7.41(2H，d，J= 8.0 Hz，H-2′，6′)，8.06(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，8.34(1H，s，H-2)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：154.1(C-2)，124.5(C-3)，174.9(C-4)，127.1(C-5)，115.9(C-6)，162.1(C-7)，102.9(C-8)，158.1(C-9)，119.3(C-10)，123.4(C-1′)，131.1(C-2′，6′)，114.9(C-3′，5′)，158.2(C-4′)，101.0(C-1″)，73.6(C-2″)，76.9(C-3″)，69.8(C-4″)，75.9(C-5″)，58.9(C-6″)。以上数据与文献[14]报道一致，故确定为大豆苷。

化合物12白色粉末；ESI-MS：m/z447.2 [M + H]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.74(3H，s，3′-OCH3)，5.13(1H，d，J= 7.5 Hz，Glc-H-1″)，6.83(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，7.06(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6)，7.15(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6′)，7.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，7.28(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，8.11(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，8.44(1H，s，H-2)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：153.8(C-2)，123.6(C-3)，175.5(C-4)，127.1(C-5)，115.8(C-6)，162.2(C-7)，104.1(C-8)，156.9(C-9)，119.2(C-10)，125.1(C-1′)，115.2(C-2′)，146.8(C-3′)，147.1(C-4′)，113.3(C-5′)，122.3(C-6′)，56.3(3′-OCH3)，101.2(C-1″)，74.2(C-2″)，77.3(C-3″)，70.6(C-4″)，76.9(C-5″)，60.8(C-6″)。以上数据与文献[14]报道一致，故确定为3′-甲氧基大豆苷。

3.2 活性实验结果

以次苦参黄素作为为阳性对照品，对所得化合物1～12进行了体外抑制DGAT1/2活性实验(见表1)。其中，化合物1、6～7和9～10对DGAT1有较好的抑制作用，而化合物1～12均对DGAT2无抑制作用。

表1 化合物1～12对DGAT1/2的抑制作用(n = 3)Table 1 Inhibitory effects of compounds 1-12 on DGAT1/2 (n = 3)

注：a通过回归分析确定IC50值，并表示为三次重复的平均值±SD；b阳性对照。

Note：aIC50values were determined by regression analyses and expressed as mean ± SD of three replicates;bPositive control.

4 结论

虽然现阶段已有大量设计和合成DGAT抑制剂的相关文献，但从植物中筛选天然DGAT抑制剂的研究报道较少。通过本次实验从刺五加茎中提取分离到十二个化合物，包括九个木脂素类(1和3～10)，一个香豆素类(2)和两个黄酮苷类(11和12)化合物。其中，木脂素类化合物6、7、9、10对DGAT1有较好的抑制作用。本研究虽然没有对刺五加木脂素类化合物与抑制DGAT构效关系进行深入研究，但为今后刺五加资源的合理开发，并进一步探索该类型化合物在细胞及动物体内的作用机制，以及寻找潜在的新型天然DGAT抑制剂提供了基础理论依据。