慢性高原病患者骨髓有核红细胞Bcl-2家族基因表达研究*

熊 华，马 婕，崔 森

(青海大学附属医院血液科，青海西宁 810001)

慢性高原病(CMS)是一种长期在高海拔环境下机体稳态紊乱所致的慢性疾病状态，并产生一系列生理功能改变。机体长期暴露于低氧环境，处于过度疲劳、睡眠不佳等状态，造成机体各器官功能的减退，甚至发生高原衰退症，其发病机制目前仍未完全明确。通过低氧暴露下机体生理变化的研究，明确了低氧与红细胞过度增加的关系，过去的研究主要关于红细胞增殖机制。近年来对CMS患者骨髓单个核细胞凋亡的研究，证明了细胞凋亡在CMS发病过程中的作用。骨髓有核红细胞是人体内产生红细胞的重要来源，本研究用流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)等实验方法检测CMS患者骨髓有核红细胞中Bcl-2家族部分分子的表达，从而了解CMS骨髓红系前体细胞凋亡变化情况，探讨Bcl-2家族蛋白在CMS患者红细胞过度增生过程中的作用，为临床积累科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年6月至2016年7月就诊于本院的26例CMS患者为CMS组，均为汉族男性，平均(50.2±11.4)岁，长期居住在海拔2 500～4 500 m青藏高原，其诊断符合第六届国际高原医学和低氧生理学术大会(中国西宁，2004年)推荐的CMS诊断标准，平均血红蛋白(Hb)为(221.90±18.04)g/L，CMS积分为(11.00±1.54)分，并排除急慢性感染、肿瘤、骨髓增殖性肿瘤、免疫相关性疾病、先天性心脏病及其他原因引起的继发性红细胞增多症等。以在同一海拔高度地区居住时间接近，并同期在本院体检的26例体检健康者为对照组，均为汉族男性，平均(46.90±13.80)岁，平均Hb为(137.07±17.60)g/L，CMS积分为(2.00±0.72)分，排除心、肺、肾等器官疾病及慢性感染疾病。在性别、年龄、种族等方面两组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。研究方案征得研究对象的同意并经本院伦理委员会审议通过。

1.2方法

1.2.1标本采集及处理 (1)选取髂后上棘为穿刺点，采集研究对象骨髓液约5 mL，收集至肝素抗凝管中，用Ficoll密度梯度分离液(美国Sigma公司)分离出骨髓单个核细胞(BMMNCs)，制成细胞悬液。(2)经研究对象肘前静脉抽血4 mL，收集至促凝采血管中，静置30 min，1 000 g 离心3 min，留取上清液。

1.2.2骨髓有核红细胞凋亡检测 在细胞悬液中加入CD71+抗体磁珠(德国美天旎公司)4 ℃放置15 min，然后400 g离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS。重悬沉淀后，400 g离心5 min，弃上清，沉淀重悬于500 μL PBS中。通过美天旎磁珠分选系统收集CD71+阳性细胞，计算CD71+细胞数。并将收集到的1×106个单个核细胞悬浮在100 μL PBS中，管中先后加入APC标记的CD71+单克隆抗体10 μL、Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL，避光孵育5 min，流式细胞术检测，获取40 000个细胞测定凋亡。

1.2.3qPCR检测 提取总RNA，使用Nanodrop 2000测定总RNA浓度。然后进行cDNA第一链的合成。后根据天根SuperReal荧光定量试剂盒配制20 μL反应体系，按反应程序进行qPCR反应，反应结束后，统计数据。

2 结 果

2.1CMS组与对照组骨髓CD71+细胞凋亡率比较 CMS组骨髓CD71+细胞凋亡率为2.40%，对照组骨髓CD71+细胞凋亡率为2.30%，两组比较，差异无统计学意义(t=0.409，P=0.686)。见图1、2。

表1 CMS组和对照组Bax、Bcl-xl、Bcl-2 mRNA水平

2.2CMS组与对照组骨髓有核红细胞凋亡相关mRNA比较 CMS组患者骨髓有核红细胞Bax mRNA表达水平较对照组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；CMS组骨髓有核红细胞Bcl-2、Bcl-xl mRNA表达水平较对照组有下降趋势，但两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3相关性分析 通过Pearson积差相关分析，两组Hb 与凋亡率、Bax mRNA均无相关性(P>0.05)，见表2。

图1 流式细胞仪检测CMS组与对照组骨髓CD71+细胞凋亡

图2 CMS组与对照组骨髓CD71+细胞凋亡率比较

表2 CMS组患者骨髓CD71+细胞凋亡率与凋亡相关mRNA水平相关性

3 讨 论

根据本研究的结果，CMS组骨髓有核红细胞Bax mRNA表达水平较对照组明显下降，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，此结果与邹成林等[1]、孙敏敏等[2]研究结果相同，提示促凋亡蛋白的下降在CMS发病机制中具有一定作用。但与其他学者不一致的研究结果是CMS组骨髓有核红细胞Bcl-2 mRNA表达水平与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。研究发现[3]，大鼠在缺血缺氧状态下，随着缺氧时间延长，其脑部Bcl-2 mRNA的表达水平与缺氧时间呈正相关关系，但极度的缺血缺氧会导致Bcl-2 蛋白的表达水平明显下降。由此可知，在某些特定条件下，Bcl-2 家族的蛋白水平并不与mRNA的表达水平一致，其原因可能与Bcl-2转录调控的多样性及转录后调控有关。现已有研究证实在正常的淋巴系统中，小淋巴细胞一级淋巴滤泡中Bcl-2的蛋白水平很高，在生发中心Bcl-2 的mRNA水平很高，但几乎检测不到其蛋白的表达，证明确实存在转录后调控方式[4-6]，抑制翻译进行的元件在不影响转录蛋白的情况下，下调此蛋白的翻译水平。在不同的组织，不同的细胞中，可能存在着不同的转录调控模式。

其次，Bcl-2 家族蛋白成员众多，其他成员如Bax、Bad、Bik等可以单独参与细胞凋亡调控，也可以和Bcl-2形成异源或者同源二聚体，使其抑制细胞凋亡的活性下降，说明Bcl-2在细胞凋亡中的作用不是独立的、单一的。研究显示，形成同源二聚体的Bcl-2和Bax促进细胞凋亡，但形成异源二聚体的Bcl-2和Bax抑制细胞凋亡，所以研究Bcl-2/Bax比值的高低变化对细胞凋亡更有意义。这一理论在急性白血病患者凋亡调控基因的相关研究中得以证实[7]。同样，Bcl-2/Bcl-xl可以抑制Bak/Bax，而Bad可以抑制Bcl-2/Bcl-xl，Bid，Bim不仅可以抑制Bcl-2/Bcl-xl，而且可以激活Bak/Bax。Bcl-2家族成员之间的相互作用受到抗体水平和亲和力的影响。并且受到许多细胞因子、转录因子的调控，其机制错综复杂[8]。

回顾既往CMS细胞凋亡机制相关的研究，也有很多不同的实验结果。追溯其原因，其中之一是选取病例的标准、骨髓采集和检测方法的差异。在张朝霞等[9]研究中，CMS患者的骨髓组织通过骨髓活检术采集，用免疫组织化学SP法检测骨髓组织中Bcl-2、Bcl-xl等蛋白的表达，与本实验的标本采集来源、实验方法均不同。骨髓活检组织与骨髓液的不同点在于骨髓组织保持了造血组织的天然结构，有核细胞群集，其内分布着各类造血细胞、间质细胞，以及多种蛋白、细胞因子等。Bcl-2 基因的转录调控研究显示许多生长因子和细胞因子可以调控Bcl-2 的表达。骨髓活检所获取的骨髓组织中内容较丰富，可能有目前不可知的某些因素对Bcl-2 的表达存在影响。因此，骨髓组织中Bcl-2家族蛋白的表达，与本研究单纯研究骨髓有核红细胞的凋亡蛋白变化之间存在一定差异。陈扬扬等[10]的研究中将骨髓有核红细胞分离出来后进行体外培养，检测培养后的有核红细胞中凋亡相关蛋白表达，其结果与本研究的结论不一致，考虑细胞离体后相对于复杂的机体，细胞培养仅仅是一种模拟状态，体外细胞培养很难建立与人体条件接近甚至相似的环境[11-12]，故体外培养的有核红细胞与骨髓液中的有核红细胞必然存在差异，这也是结果不同的原因之一。本研究经过多步骤实验，最终的研究对象是CD71+骨髓有核红细胞，继而测得骨髓有核红细胞的Bcl-2家族mRNA表达水平。CD71是有核红细胞表面表达的重要抗原标志之一，特别是在早幼、中幼红细胞等红系前体细胞中有更高水平的表达，随着有核红细胞进一步分化成熟CD71抗原表达逐渐下降，成熟红细胞表面无CD71抗原表达，因此用CD71+细胞来代表骨髓有核红细胞，具有特异性，亦更有价值、更可靠[13]。相对于体外培养的骨髓有核红细胞，本研究更接近人体实际情况。

本研究中CMS组与对照组外周血Hb与骨髓有核红细胞凋亡率及Bax mRNA表达水平均无相关性。此结论与前期的部分研究结果有所不同[14-18]，提示在CMS患者发病机制中有核红细胞及成熟红细胞的过度增殖仍可能是其主要的作用机制，而骨髓有核细胞凋亡可能对红细胞的积累有一定的影响，今后还需加大样本量，建立更加适宜的实验模式，选取更可靠的实验方法，继续深入研究。

4 结 论

本研究以高原地区常见病CMS患者为研究对象，具有明显的地域特色。本研究在既往实验结果基础上，采用流式细胞术及qPCR两种不同的实验方法，测定骨髓CD71+细胞(有核红细胞)凋亡率，结果更接近实际情况。该研究的实验结果与前人研究结果有所不同，可能与标本采集、研究方法等因素相关。在将来的研究中需要进一步扩大样本量，运用多种不同的实验方法进行研究，互相印证，取长补短，进而得出更加接近实际情况的结论，为CMS的预防及治疗提供可靠的理论依据，继而解决高原病所带来的社会问题。