玻璃化冻融助孕胎盘DNMT1、GCN5、HDAC1 表达研究

林冠 祁伟 杜生荣 林典梁 易劲松

体外受精-胚胎移植技术（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET），是重要的辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）。玻璃化冷冻作为ART 重要的辅助技术，已得到广泛应用。其应用快速降温法及冷冻保护剂，使细胞外周呈玻璃态，同时细胞内不产生冰晶，减少了渗透压及激冷的变化对细胞内外造成的机械损伤。配子和胚胎发育早期是表观遗传修饰的关键时期，基因印记（genomic impriting）也在此期间擦除和重建。表观遗传效应在哺乳动物胚胎发育早期中起重要的作用，但目前尚无确切证据表明包括玻璃化冷冻在内的技术是否对此时期的表观遗传修饰产生影响[1]。DNA 与组蛋白共同组成核小体，是染色质的基本组成单位；组蛋白可以通过共价修饰发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等改变,籍此组成各式各样的组蛋白密码，传递不同的遗传信息。就组蛋白修饰（histone modification）的形式而言，甲基化修饰是最稳定、最具代表性的，而乙酰化则有较高的可变性。在表观遗传学修饰中，DNA 甲基化被广泛研究，DNA 甲基转移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）是催化DNA 甲基化（DNA methylation）的关键，其表达水平可间接反映DNA 甲基化水平。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferases，HATs）和去乙酰化酶（histone deacetytransferases，HDACs）共同维持，而HATs 和HDACs 最关键、具代表性的酶分别是组蛋白乙酰基转移酶GCN5（general control of nucleotide synthesis， GCN5）和组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase1， HDAC1）。GCN5 及HDAC1 均表达在细胞核内，不仅共同维持组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡，也同时调控基因。胎盘被认为是胎儿表型的主要决定因素，可作为用于分析与生长和发育结果相关的印迹基因表达谱的适当组织[1-2]。而GCN5、HDAC1 和DNMT1 可作为印迹基因的代表，故通过研究助孕妊娠妇女胎盘中上诉基因的表达情况，可以从表观遗传角度评估玻璃化冻融囊胚助孕技术的安全性。

1 一般资料与方法

1.1 一般资料

收集2014 年5 月—2016 年5 月间在福建省妇幼保健院以玻璃化冻融囊胚助孕妊娠并分娩的妇女50 例（观察组）、按年龄配对选择同期自然妊娠妇女50 例（对照组）的胎盘标本和临床资料。分析比较两组孕妇的人口学资料，差异无统计学意义（ P ＞0.05）。两组孕妇均长期留居本地，其年龄、民族、文化程度和受教育情况等均无显著差异。本研究方案经由福建省妇幼保健院医学伦理委员会讨论通过，经研究对象充分知情同意并获得患方夫妻双方书面签字后实施。入选标准：受孕年龄在20 ～35 岁；首次妊娠；既往身体健康无高血压、糖尿病、血液病等病史。排除标准：孕24 周前妊娠丢失。所有孕妇均分别记录姓名、末次月经、孕周、预产期、分娩方式、分娩孕周、妊娠合并症、并发症等情况。

1.2 方法

1.2.1 胎盘标本采集 孕妇分娩后立即收集胎盘组织，仔细检查并测量胎盘大小及重量，记录所有相关数据。避开胎盘梗死、钙化和血管瘤部分，从脐带插入点旁开5 cm 处纵向切开胎盘组织，收集胎盘中间部位绒毛组织；存在异常脐带植入（如帆状胎盘）者除外。加入4%多聚甲醛固定液用于免疫组织化学分析。

1.2.2 免疫组织化学法检测胎盘组织中DNMT1、GCN5 和HDAC1 的表达 将组织的石蜡标本制成3 ～5 μm 厚切片，石蜡组织切片标本依次经过脱蜡、冲洗、抗原修复，消除内源性过氧化物酶活性，滴加封闭血清，封闭非特异性结合位点，分别滴加一抗和二抗，孵育、DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。分别对试验组和对照组进行100×和400×的显微照相。结合镜下观察所见阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项标准，半定量判断结果。按以下评分标准：A为阳性细胞数分级：0 ～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B 为阳性细胞着色强度分级：0（不着色，阴性）、1（浅黄色，弱阳性）、2（棕黄色，阳性）、3（棕褐色，强阳性）；IHS=A×B。对所有胎盘组织切片均进行镜下观察，分析DNMT1、GCN5 和HDAC1 蛋白的表达。

1.3 统计学方法

使用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。计量资料用 （）表示，采用t 检验；计数资料用（n，%）表示，采用χ2检验，不适用χ2检验者，则用Fisher 确切概率法。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘称量结果比较

胎盘称量结果显示，玻璃化冻融囊胚助孕组胎盘重量、胎盘面积均显著大于自然妊娠组，差异有统计学意义（P ＜0.05），如表1 所示。

2.2 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘DNMT1 免疫组化分析

免疫组织化学染色结果显示，两组病例中胎盘滋养层细胞均可见DNMT1 的表达，如图1 所示。表2 所示为两组胎盘DNMT1的表达差异。两组胎盘组织DNMT1 蛋白在表达率、表达强度、IHS 方面差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

图1 胎盘DNMT1 免疫组化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化冻融囊胚助孕妊娠组；B 自然妊娠组）

2.3 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘GCN5 免疫组化分析

免疫组织化学染色结果显示，两组样本中胎盘滋养层细胞均可见不同程度GCN5 蛋白的表达，如图2 所示。两组胎盘组织GCN5 表达率、表达强度、IHS 比较上均差异无统计学意义（P ＞0.05）。详见表3。

图2 胎盘GCN5 免疫组化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化冻融囊胚助孕组；B 自然妊娠组）

表1 玻璃化冻融囊胚组与自然妊娠组胎盘称量结果比较 （ ）

表1 玻璃化冻融囊胚组与自然妊娠组胎盘称量结果比较 （ ）

组别 胎盘重量（g） 胎盘面积（cm2）玻璃化冻融囊胚助孕组（n=50） 792.26±242.95 870.18±364.82自然妊娠组（n=50） 642.40±111.65 743.68±208.29 t 值 3.963 2.129 P 值 ＜0.001 0.036

表2 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘组织DNMT1 表达免疫组化结果 （ ）

表2 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘组织DNMT1 表达免疫组化结果 （ ）

组别 DNMT1 表达率% DNMT1 表达强度 DNMT1 IHS玻璃化冻融囊胚助孕组（n=50） 22.36±5.43 1.80±0.67 43.68±25.82自然妊娠组（n=50） 22.04±5.28 1.74±0.60 41.12±22.59 t 值 0.299 0.472 0.528 P 值 0.766 0.638 0.599

表3 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘组织GCN5 表达免疫组化结果 （ ）

表3 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘组织GCN5 表达免疫组化结果 （ ）

组别 GCN5 表达率% GCN5 表达强度 GCN5 IHS玻璃化冻融囊胚助孕组（n=50） 18.36±5.17 1.68±0.47 33.20±15.47自然妊娠组（n=50） 18.06±4.97 1.58±0.50 30.52±15.12 t 值 0.296 1.031 0.876 P 值 0.768 0.305 0.383

表4 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组病例胎盘组织HDAC1 表达免疫组织化学分析结果 （）

表4 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组病例胎盘组织HDAC1 表达免疫组织化学分析结果 （）

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表5 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组产科结局比较 （ ）

表5 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组产科结局比较 （ ）

玻璃化冻融囊胚助孕组（n=50） 自然妊娠组（n=50） t/χ2 值 P年龄（岁） 26.44±1.94 26.20±2.25 0.571 0.569分娩孕周（周） 38.02±1.78 38.64±1.95 1.663 0.099胎儿发育早产儿（%） 3 （6.00） 6（12.00） - 0.487足月儿（%） 47（94.00） 44（88.00） - 0.487妊娠期并发症 - -先兆流产（%） 12（24.00） 1（2.00） 10.698 0.001胎膜早破（%） 6（12.00） 5（10.00） 0.102 0.743胎位异常（%） 3（6.00） 2（4.00） - 1.000羊水过多（%） 1（2.00） 1（2.00） - 1.000妊娠期高血压疾病（%） 1（2.00） 0 - 1.000妊娠期糖尿病（%） 3（6.00） 4（8.00） 0.083 0.773脐带异常（%） 14（28.00） 5（10.00） 0.493 0.482胎盘早剥（%） 0 1（2.00） - 1.000产后出血（%） 2（4.00） 1（2.00） - 1.000妊娠合并症 - -贫血（%） 3（6.00） 1（2.00） - 0.617甲亢（%） 0 1（2.00） - 1.000分娩方式 - -顺产（%） 13（26.00） 36（72.00） 19.368 ＜0.001

2.4 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组胎盘HDAC1 免疫组化分析

免疫组织化学染色结果显示，两组样本中胎盘滋养层细胞均有HDAC1 蛋白的表达，如图3 所示。两组胎盘HDAC1 的表达比较见表4。两组胎盘中HDAC1 在表达率、表达强度、HIS 评分方面差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

图3 胎盘HDAC1 免疫组化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化冻融囊胚助孕组；B 自然妊娠组）

2.5 玻璃化冻融囊胚助孕组与自然妊娠组产科结局比较

观察组及对照组产科结局比较结果表5 所示：玻璃化冻融囊胚助孕组先兆流产风险、剖宫产率均高于自然妊娠组（P ＜0.05）；而其在分娩孕周、早产率、妊娠期并发症、妊娠合并症、分娩方式的组间差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

3 讨论

表观遗传学属于研究细胞调控基因表达的一门学科，其研究基因在其遗传密码或核苷酸序列不改变的状态下表达可遗传的变异的机制[3]。目前已了解的表观遗传现象包括有基因组印记[4]、DNA 甲基化、组蛋白修饰、基因沉默（gene silencing）、休眠转座子激活等。基因组印记指来自精子和卵子的等位基因在形成合子细胞后进行通过修饰、使得子代的等位基因只单独表达父系或母系的遗传信息的现象，以DNA 甲基化最为常见。原始生殖细胞早期分化中，通过等位基因的甲基化，大部分表观遗传信息被删除，然后合子的基因组开始进行第一轮表观遗传重编程[4-5]。若印记基因改变发生在配子形成和植入前生长发育阶段，可破坏正常的生长和发育，导致印记基因表达异常，常引起众多伴随有突变和表型缺陷的疾病[6-7]。人工辅助生殖技术使得配子形成的场所转到了人工构建的环境下，有研究认为不同的培养环境和操纵技术对印记基因表达有影响，可能导致此阶段的错误随机发生[6-8]。玻璃化冷冻技术使用高浓度的乙二醇（EG）等冷冻保护剂以达到快速、不结冰晶、减少细胞损伤风险的效果；但有报道可使参与表观修饰的关键蛋白酶（如Dnmt3等）表达下降，可能会影响组蛋白修饰及DNA 甲基化状态，影响表观遗传修饰，从而引起表观遗传的改变[9-10]。

胎盘是印记基因表达的主要器官之一[11]，胎盘滋养层细胞能否正常发育、分化直接影响着胎盘的生长及功能。而印迹基因的异常或可影响胎盘结构，影响胚胎的发育，造成胎源性疾病的产生。有研究通过动物模型发现辅助生殖可影响胎盘发育及其功能，致胎盘效率下降，进而影响胎儿宫内发育及出生体质量;同时还发现，辅助生殖操作可通过干扰早期胚胎表观印迹影响胎盘发育及功能，进而影响胎儿发育及出生体质量[12]。本研究通过比较两组胎盘组织中DNMT1，GCN5 和HDAC1 蛋白在表达率、表达强度、IHS 评分的不同，发现其均无显著性差异，提示玻璃化冻融操作未对上述与表观修饰相关酶的表达产生影响，间接说明该项助孕技术所构建的胚胎与自然受孕的胚胎无明显的表观遗传学差异。表观遗传修饰依赖于各种蛋白酶与相关蛋白结合，而慢速冷冻形成的冰晶可能影响蛋白质活性，进而影响基因编辑过程。玻璃化冷冻抑制细胞内外冰晶的形成，并防止渗透性休克，从而减少对活细胞及蛋白质的损害，在不改变表观遗传修饰的情况下，能提高卵母细胞复苏后的成功率[13]。但本研究只对以上三种表观遗传修饰相关蛋白酶进行了分析，为全面评估玻璃化冻融囊胚的表观遗传基因表达，有待于扩展基因种类、扩大样本例数以进一步研究。

本研究显示玻璃化冻融囊胚助孕组胎盘重量和面积大于自然受孕组，这与国内外主流研究结果相符[14-15]。本研究又分别对观察组与对照组的一些产科结果进行比较，结果显示观察组先兆流产发生率、剖宫产率均较对照组显著升高（P ＜0.05），而其他观察指标比较均无差异。流产原因多种多样，其与包括DNA 甲基化在内的表观遗传修饰所导致的胚胎不健全、胎盘形成异常是否有关目前尚无定论；而在人口基数大的我国，出于多种考量，辅助生殖受孕本身即是剖宫产指征，故不能单凭以上两率升高而否定辅助生殖技术。国内乔杰院士团队[16]的一项荟萃分析通过分析快速冷冻程序对胚胎存活率、成熟率、受精率等和临床风险率的风险比，也认为与新鲜和慢速冷冻程序相比，成熟卵母细胞和胚胎的玻璃化获得了更好的临床结果，且没有增加DNA损伤、基因组印记、和胚胎非整倍性的风险。贺丽人等[17]也回顾分析1 237 例接受ART 成功妊娠和5 040 例自然受孕的围产结局，结果显示ART 组的剖宫产率、多胎妊娠率、前置胎盘、妊娠期高血压、妊娠期肝内胆汁淤积症、产后出血、早产和低出生体质量率等均显著高于自然受孕组。这些研究的部分结论也与此次研究结果一致，即玻璃化冻融囊胚助孕是一项安全的人工辅助生殖技术，可获得与自然妊娠相似的妊娠结局。但本研究时限较短，纳入样本量有限，亦有待于扩大样本容量、延长研究周期以进一步印证。

综上，玻璃化冻融囊胚助孕技术不改变胎盘中GCN5，HDAC1 和DNMT1 的表达，且不增加妊娠期产科主要并发症及围产儿风险；但有可能与先兆流产和剖宫产的发生率增加有关。在目前，该技术是一种安全有效的助孕技术。