三株未知菌的鉴定和药物敏感性试验

陈 建 派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500

猪瘟疫苗生产的原料就是大兔，所以对挑选原料兔有严格的规定。在生产猪瘟疫苗时，也有明确规定，采取的脾脏和淋巴必须保证无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染 （参照中华人民共和国兽药典3306、3307和3308）。抗生素是治疗大兔疾病不可缺少的药物，但是抗生素的滥用很容易使细菌产生抗药性。近年来，为了促进大兔的生长发育，抗生素作为饲料添加剂已经得到普遍应用，抗生素在预防和治疗细菌性感染上效果明显，但大兔不是所有的抗生素都能使用的。生产实践证明，在养兔生产中滥用抗生素是不可取的。抗生素可以破坏兔盲肠内正常的微生物菌落，影响消化，甚至可导致疾病。原因是抗生素有个致命的问题，就是抗生素通常会将肠道内的有益菌一起“通杀”，这不但会破环肠道内菌群的平衡、使有害菌伺机大量繁殖而产生致命毒素外，还有可能令正常的菌群数量减少或消失，这可能比任何疾病都来得严重，因为兔主要是依赖盲肠中微生物（有益菌）的分解来消化食物，也就是说，吃进去的食物先由肠道中种类繁多的微生物（有益菌）分解之后，大兔才可吸收，杀死了这部分细菌，无异于直接杀死兔子。在疫情发生时，不仅需要而且应该及时使用抗生素进行预防和治疗，这都是无可非议的。在实际生产中，很多养殖场(户)滥用抗生素的情况非常普遍，不仅没有起到防病治病的作用，反而导致了各种问题的发生，如死胎、流产、中毒、营养不良等。

某兔场大兔出现腹泻、身体消瘦，死亡率很高。分别采集腹泻的、身体消瘦的大兔及不给小兔喂乳（且腹泻）的母兔脾脏和淋巴样品进行无菌检验，检出3株未知细菌，样品编号分别为P1102、L1103和L1104。为了鉴定3株未知菌，采用平板培养法、液体培养法、PCR鉴定法和药物敏感性试验进行细菌菌种鉴定及耐药试验。结果判定样品P1102为葡萄球菌，L1103与L1104为大肠杆菌，现报道如下。

表1 采样及检验情况

表2 引物序列

1 材料和方法

1.1 样品来源 在无菌条件下分别采集腹泻的、身体消瘦的大兔及不给小兔喂乳（且腹泻）的母兔脾脏和淋巴样品，捣碎，进行无菌检验，见表1。取其中长有未知细菌的血斜样品P1102、长有未知细菌的硫乙醇样品L1103和L1104（均源自2018年4月某兔场）作进一步试验。

1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、LB培养基、药敏纸片，购自北京陆桥技术股份有限公司；2×EasyTaqTM PCR SuperMix、DL2000 DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物 参考Weisburg W G等[1]文献报道的未知细菌的16S扩增引物序列（见表2），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 细菌分离及纯化培养 分别挑取样品P1102号血斜内菌落，吸取少量L1103与L1104液体接于TSA平板、划线，置37℃恒温箱培养12 h，次日，挑取单菌落继续接于TSA平板、划线，置37℃恒温箱培养12 h。分别挑选样品均匀一致的数个菌落接种于LB培养基，37℃静置培养24 h，观察细菌的生长情况。

1.5 PCR扩增 PCR反应体系为50 μL：分别加入2×EasyTaqTM PCR SuperMix 250 μL，菌液 1 μL，两对 引 物 （FD1+RD1）与 （FD1+RP2）各 1 μL，ddH2O 24 μL。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 60 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。以双蒸水为空白对照，将扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统进行观察。将阳性样品送铂尚生物工程（上海）有限公司进行测序。

1.6 药敏试验 药敏试验按常规K-B法进行[2]，挑取分离培养的单个典型菌落于LB培养液中培养16 h，取适当稀释菌液均匀涂布在琼脂平板上，平板置室温下干燥3～5 min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，置37℃恒温箱内8～12 h后观察结果，判断标准参照CLSIM100-S20[3]。

2 结 果

图1 3株菌平板培养菌落形态

2.1 细菌分离结果 从分离菌落的形态上可以发现，P1102的菌落为白色原点；L1103与L1104的菌落形态比较接近，都为半透明状（见图1）。

2.2 PCR扩增结果 用FD1+RD1对引物进行PCR扩增，可以看到P1102、L1103、L1104都出现约1 500 bp的条带。采用FD1+RP2对引物进行PCR扩增，未出现阳性条带（见图2-图3）。

图2 FD1+RD1 PCR结果

2.3 测序比对结果 经过测序，将样品P1102、L1103和L1104的序列在NCBI进行BLAST比对，结果P1102与登录号为MG460585（葡萄球菌CAU 1472株）的序列同源性为100%；L1103与登录号为CP009104（大肠杆菌菌RM 9387株）的序列同源性为100%；L1104与登录号为CP023349（大肠杆菌菌Ecol 2264株）的序列同源性为100%[4-8]。判定样品P1102为葡萄球菌，L1003与L1004为大肠杆菌[9]。

图3 FD1+RP2 PCR结果

2.4 药敏试验 药敏试验结果见图4、表3。

P1102株敏感的药物有11种：阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考、诺氟沙星、青霉素、利福平、多西环素、新霉素、左氧氟沙星、头孢挫林和氧氟沙星；中介的药物有3种：丁胺卡那、环丙沙星和大观霉素；耐受的药物有9种：多粘菌素B、复方新诺明、红霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素和四环素。

图4 药敏纸片平板抑菌情况

L1103株敏感的药物有3种：左氧氟沙星、头孢挫林和氧氟沙星；中介的药物有2种：多粘菌素B和大观霉素；耐受的药物有18种：阿莫西林、氨苄西林、丁胺卡那、复方新诺明、氟苯尼考、诺氟沙星、青霉素、红霉素、环丙沙星、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、链霉素、多西环素、庆大霉素、四环素和新霉素。

L1104株敏感的药物有6种：多粘菌素B、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢挫林和氧氟沙星；中介的药物有2种：丁胺卡那和大观霉素；耐受的药物有15种：阿莫西林、氨苄西林、复方新诺明、氟苯尼考、青霉素、红霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、链霉素、多西环素、庆大霉素、四环素和新霉素[10-11]。

表3 3株分离菌药敏试验结果

3 讨 论

本次试验鉴定了一株葡萄球菌（P1102）、两株大肠杆菌（L1103和L1104），3株分离菌均呈现多重耐药性。随着养殖业的发展，抗生素的滥用现象越来越普遍，造成细菌耐药性也越来越强。结果是使用常规药物无法控制病情，造成巨大的经济损失。从药物敏感试验结果表明，分离菌P1102对阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考等11种药物敏感，对多粘菌素B、复方新诺明、红霉素等9种药物耐受。分离菌L1103仅对左氧氟沙星、头孢挫林和氧氟沙星3种药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、丁胺卡那等18种药物耐受。分离菌L1104敏感的药物有6种，分别为多粘菌素B、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢挫林和氧氟沙星；耐受的药物多达15种，分别为阿莫西林、氨苄西林、复方新诺明、氟苯尼考、青霉素、红霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、链霉素、多西环素、庆大霉素、四环素和新霉素。

取样的母兔未患乳房炎，但小兔出现腹泻，母兔脾脏捣碎后检测含有葡萄球菌。小兔腹泻、不给小兔喂乳，通常是由于母兔患有乳房炎，但抗生素的滥用可能导致母兔没有患乳房炎但小兔喝奶后直接引起腹泻。由此可见，抗生素的规范使用必须得到重视，怀疑发生细菌性感染时，应根据药敏试验结果和国家相关规定合理用药。